利用广亲和基因S5-n的功能标记鉴定特殊配组类型杂交种纯度研究

2020-12-22 14:26张馨月李友发刘江宁富昊伟
浙江农业学报 2020年1期
关键词:杂交种条带纯度

张馨月,李友发,刘江宁,富昊伟

(嘉兴市农业科学研究院,浙江 嘉兴 314016)

籼稻(OryzasativaL. ssp.indica)和粳稻(OryzasativaL. ssp.japonica)是栽培稻(OryzasativaL.)的两个亚种,且亚种间杂种具有很强的杂种优势。但长期以来,籼粳亚种间杂种中存在的育性障碍导致杂种结实率很低,限制了杂种优势的利用。IKehashi等[1-2]首次提出广亲和理论,认为广亲和性基因与籼粳稻的杂种不育基因互为复等位基因,遗传符合单位点孢子体-配子体互作模式,并将广亲和基因定位。杨杰等[3]根据水稻复等位基因S5-n、S5-i和S5-j的DNA序列的差异设计了功能标记S5136,对有广亲和基因S5-n的品种DNA,能够扩增出441 bp的片段,而没有S5-n的品种DNA扩增出577 bp片段,能快速有效地检测广亲和基因的存在(纯合、杂合均有标准性条带),可以快速高效地区分杂种一代和不育系,从而达到纯度鉴定的目的,为分子标记辅助选择育种和资源筛选鉴定提供了便利。

浙江省籼粳亚种杂交稻选育的配组方式,是将广亲和基因导入纯籼型恢复系,然后与不带广亲和基因的纯粳不育系配组。该配组方式应用广泛,宁波市农业科学研究院的“甬优”组合为代表,浙江省农业科学院的“浙优”系列、浙江大学的“江两优”系列、嘉兴市农业科学研究院的“嘉优中科”系列均采用此种配组方式。据不完全统计,2018年此类“粳不育系/广亲和恢复系”配成组合的推广面积已达15万hm2以上。这种配组方式杂种一代的基因型是S5-j/S5-n,不育系的基因型是S5-j/S5-j。我们育种过程中安排生产长粳1A和6个恢复系的制种时,在制种田实地观察到长粳1A在田间有散粉现象,为验证F1后代是否存在纯度问题,以及比较广亲和基因分子标记在“粳不育系/广亲和恢复系”配成组合杂交种中的鉴定效果。种子收获后我们同时进行广亲和基因分子标记和大田统计鉴定纯度,并将两种鉴定效果进行比较分析。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验所用种子为2018年夏秋季在浙江制种收获的长粳1A和6个恢复系杂交所得的杂交种。不育系为“三系”BT胞质的粳稻不育系,恢复系均为嘉兴市农业科学研究院和浙江大学团队选育的带广亲和基因的籼型恢复系。试验杂交水稻F1共6个,分别依次编号为鉴1、鉴2、鉴3、鉴4、鉴5、鉴6。

1.2 试验设计

大田试验安排在海南陵水进行。取各组合种子20 g,正常浸种催芽后,于12月5日播种,12月30日移栽。

1.3 测定内容与方法

1.3.1 大田水稻组合纯度鉴定

各组合于2月20日左右齐穗。我们于3月5日对杂株总数及各类型杂株的数量进行调查。

纯度(%)=(种植总株数-杂株总数)/种植总株数×100%。

1.3.2 分子标记纯度鉴定

将供试种子在50 ℃热水中浸泡36 h,然后置于纸床上放在28 ℃光照条件下培养,生长7 d(叶片长度约5 cm)剪取叶片备用。

等位基因特异PCR引物设计:广亲和基因功能基序(function motif)已经非常明确。S5-n与S5-i和S5-j的序列差异是在翻译起始点即ATG上游缺失69 bp,下游缺失67 bp,导致基因功能丧失,不能与S5-i和S5-j互作,杂种胚囊发育正常。根据其缺失位置两侧序列,利用软件Primer Premier 5设计引物序列,S5136-For为5′-ATCAACCCATTTCCTTTCCT-3′,S5136-Rev为5′-ATACGCTCGATCGGATTAAC-3′。引物由Invitrogen中国公司合成。

水稻基因组DNA快速提取,PCR扩增、电泳及结果记录参照赵国珍等[4]的方法,具体步骤为:剪取约0.5 cm长的叶片,置96孔PCR板中,每孔加入70 μL溶液A(包含100 mmol·L-1NaOH和2% Tween 20,现配现用);将96孔板在-70 ℃冰柜中冷冻10 min,转至PCR仪上95 ℃加热10 min;每孔加70 μL缓冲液B(包含100 mmol·L-1Tris-HCl和2 mmol·L-1EDTA),充分混匀后1 500 r·min-1离心1 min,取上清液用于PCR。采用超微量分光光度计Nano-Drop 2000(Thermo Scientific, 美国)测定DNA的浓度及质量。PCR扩增以总DNA为模板,PCR反应体系(15 μL),上、下游引物各1.0 μL,10×PCR buffer 1.7 μL(含Mg2+),TaqDNA聚合酶0.2 μL,2.5 mmol·L-1的dNTP 0.2 μL,ddH2O 7.9 μL,模板3 μL。PCR反应程序:预变性94 ℃ 5 min;变性94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,退火72 ℃ 30 s,35个循环;延伸72 ℃ 10 min。PCR产物在含有溴化乙锭(EB)的1.0%琼脂糖凝胶中110 V电泳30 min,放入凝胶成像系统拍照。分子标记杂合条带为真实F1代杂交种,单条带的为杂株,空白条带为无效扩增结果,其中计算纯度时需减去空白的条带数。即:纯度(%)=杂合条带/(扩增条带总数-空白条带)×100。

2 结果与分析

2.1 大田统计鉴定“粳不育系/广亲和恢复系”水稻配组F1代杂交种纯度

6个组合纯度的田间统计鉴定结果见表1。不育系、保持系、异形株的判定均根据农艺特性由经验判定。

2.2 分子标记鉴定“粳不育系/广亲和恢复系”水稻配组F1代杂交种纯度

图1是各F1代纯度分子标记鉴定的凝胶电泳图像。杂合条带为真实F1,单条带为杂株,空白条带为无效扩增结果,计算纯度时应排除。对比表1和表2纯度结果,除鉴6分子标记鉴定较大田统计鉴定的纯度低13.4百分点外,其他F1代的分子标记鉴定结果均高于大田统计鉴定结果。

杂株总株数=不育系+保持系+异形株。
The number of false-hybrid = The number of male-sterile line + The number of maintainer line + The number of plant with different agronomic traits.

3 讨论

广亲和基因S5-n的功能标记检测可快速测种子纯度[5-6]。但广亲和基因分子标记检测种子纯度也存在一些局限,如该方法仅能检测特定的籼粳交组合,即只有父本或母本一方有广亲和基因的配组方式,此种方式的F1代种子的扩增条带结果表现为:杂合条带为真实F1,而单条带为自交不育系。当父母本均具有广亲和基因或父母本均不具有广亲和基因的配组方式时,广亲和基因S5-n的功能标记进行检测纯度的方法失效,因为该两类配组方式的F1代种子、自交不育系的扩增条带结果均为单条带,不能达到有效区分真实F1和自交不育系的目的。广亲和基因S5-n的功能标记分子标记检测能精确区分的假杂种主要是:自交不育系、混杂的保持系、制种中田间自生苗(不具有广亲和基因)及收获环节的混杂种子(不具有广亲和基因)。此外,本试验发现,分子标记检测的种子纯度较田间经验检测的纯度高1.0~2.0百分点,这可能是如下原因所致:不育系不具有广亲和基因,这6个试验组合是嘉兴市农业科学研究院试验基地采用薄膜隔离的小制种,制种区外存在较多的广亲和恢复系,较易发生由于周围广亲和恢复系串粉导致的F1代杂交种,这种F1代杂交种农艺特性与真实F1表现不一致,为异形株,大田鉴定将其列为杂株,但广亲和基因S5-n的功能标记检测该F1代杂交种时却表现为双条带,不能与真实F1进行准确地区分,因此导致分子标记鉴定结果高于大田统计结果。除此之外,若一个配组中不育系具有广亲和基因,那么大田容易出现由于非广亲和恢复系串粉而导致的F1代杂交种,也会导致广亲和基因S5-n的功能标记检测的结果偏高。目前这两种配组的F1代杂交种在实际生产实践中还需要采用传统的大田种植条件下通过观察植株的大田农艺性状来鉴定。因此,在实际应用广亲和基因S5-n的功能标记检测杂交种纯度时可考虑对结果稍加修正。未来还需要进一步优化广亲和基因分子检测技术的特异性,进一步提高分子检测的准确性,这将对杂交稻的安全生产具有重要的实践意义。

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