厄贝沙坦对心肌梗死大鼠血清HGF水平的影响

于俊民 张小波 李大鹤 赵园园 陈洪叶

哈尔滨医科大学附属第四医院老年病一病房，黑龙江哈尔滨 150001

心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）后心肌细胞凋亡等一系列变化引起心肌纤维化、心力衰竭，使患者死亡率明显升高。心肌纤维化的发生机制复杂，肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）及多种细胞因子参与其发生过程。血管紧张素受体拮抗剂（ARBs）通过阻断AngⅡ1型受体使血管舒张，降低醛固酮合成及分泌。文献报道肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）和胰岛素生长因子 1（insulinlike growth factor 1，IGF-1）的控制与释放显著增加血管生成，减少细胞凋亡，改善心室重塑及心脏功能[1]。HGF是由间质细胞衍生的多功能细胞因子，有学者证实HGF调节其他促纤维化细胞因子的产生，参与肝、肾、心、肺等多种器官的结构重建，起到器官保护作用，是少数能阻止纤维化的生长因子之一[2]。在心肌梗死患者应用厄贝沙坦治疗过程中笔者观察到外周血中HGF细胞因子的水平存在变化[3]，但其如何发挥作用，是否受其他细胞因子影响尚不清楚。本实验通过观察厄贝沙坦对心肌梗死大鼠血清HGF水平的影响，探讨其改善心肌梗死后心肌纤维化的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

正常2～3月龄雄性Wistar大鼠26只 （长春亿思实验动物技术有限责任公司提供），体重（250±30）g。

1.2 仪器与材料

厄贝沙坦（安博维，德国赛诺菲制药公司）；HGF ELISA试剂盒（美国R&D公司）；小动物呼吸机（哈佛大学制造，55-705B型）；离心机（飞鸽牌DL-50000B）；电子天平（上海精科公司，MP200A）；病理切片机（德国菜卡，2135 型）；图像采集系统（moticam3000）；酶标仪（Tecan Infinite Pro，200 型）。

1.3 实验方法

1.3.1 心肌梗死模型制备 大鼠称重后以1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，气管插管后用小动物呼吸机有氧正压通气。于左侧胸腔第四肋间逐层开胸，开放心包后挤压右侧胸腔使心脏暴露于胸腔外，用丝线结扎左冠状动脉前降支后，将心脏放回正常位置，并逐层缝合胸腔。恢复自主呼吸后拔管，保温待其清醒[4]。另设假手术组，采用相同方法冠状动脉处穿线不结扎。

1.3.2 实验分组 选择建模成功24 h后存活大鼠随机分为厄贝沙坦组（n=11）及对照组（n=9），另设假手术组（n=6）。 厄贝沙坦组予以厄贝沙坦[50 mg/（kg·d）]，对照组及假手术组予以等体积生理盐水灌胃，1次/d，4周后处死。

1.3.3 血清HGF浓度测定 术后24 h、1、2、4周经眶后静脉丛取血5 ml，采用ELISA法测定血清HGF水平。

1.3.4 组织形态学观察 于实验终点处死大鼠，取结扎线下部分心肌组织，4%多聚甲醛液固定，石蜡包埋，制备6 μm的组织切片，HE染色后，于光镜下观察。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用多因素重复测量资料方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌组织HE染色

缺血心肌HE染色可见假手术组心肌细胞排列整齐，少量炎性细胞浸润。对照组与厄贝沙坦组心肌细胞溶解断裂，心肌结构紊乱，细胞核溶解消失，成纤维细胞浸润，厄贝沙坦组病理改变较对照组减轻（图1）。

图1 大鼠缺血心肌HE染色结果（400×）

2.2 大鼠血HGF检测结果分析

术后24 h各组血清中均检测到HGF水平，组间差异无统计学意义（P＞0.05）；假手术组1周时的HGF水平低于术后24 h（P＜0.01），术后2、4周时的HGF水平升高但仍低于术后 24 h（P＜0.01）；术后 1、2 周时对照组及厄贝沙坦组的HGF水平均高于假手术组（P＜0.01），而术后2、4周时厄贝沙坦组的HGF水平较对照组明显降低（P＜0.01）；对照组术后1、2周时的HGF 水平较术后 24 h 增高（P＜0.01），术后 2、4 周时的 HGF 水平高于术后 1 周时（P＜0.05，P＜0.01），而厄贝沙坦组术后4周时的HGF水平较术后24 h、1周时降低（P＜0.05，P＜0.01）（表1）。

表1 各组大鼠不同时间段血HGF水平的比较（pg/ml，±s）

表1 各组大鼠不同时间段血HGF水平的比较（pg/ml，±s）

与假手术组同一时间点比较，*P＜0.01；与对照组同一时间点比较，#P＜0.01；与同组 24 h 比较，ΔP＜0.01，★P＜0.05；与同组 1 周比较，▲P＜0.05，※P＜0.01

组别 术后24 h 术后1周 术后2周 术后4周假手术组（n=6）对照组（n=9）厄贝沙坦组（n=11）492.66±54.81 484.38±16.21 464.41±26.48 409.74±97.29Δ 544.75±22.14*Δ 495.59±40.91*421.78±103.58Δ 513.60±18.79*Δ▲453.50±36.35#442.81±25.09Δ 507.63±22.90*※418.34±36.50#★※

3 讨论

AMI是临床常见急症，患者发生严重冠状动脉微循环障碍及心室重塑，导致主要不良心血管事件（major adverse cardiovascular events，MACE） 发生率显著增加，预后不良[5]。心肌纤维化是心脏成纤维细胞活性增加，过度产生细胞外基质的过程[6]。AMI后心肌纤维化发生心力衰竭及猝死[7]。心肌纤维化过程的干预对梗死后心肌损伤修复、心功能改善有重要临床意义。心肌纤维化是一个复杂的病理过程且调节因素众多[8]，伴随着多种细胞因子生成及相关信号通路的活化。有学者发现生长因子及其酪氨酸激酶受体对于调节细胞周期、维持心脏功能有重要作用[9]；Sonnenberg等[10]对心肌梗死大鼠植入HGF基因片段发现HGF能促进血管新生、抑制心肌纤维化；Zhang等[11]对猪AMI模型注入HGF-MSCs发现缺血心肌血管密度增高；Met蛋白与HGF结合后可导致下游多种信号转导通路的激活从而发挥生物学效应[12]；HGF与其受体c-Met结合并激活该受体的酪氨酸激酶活性，可以促进多种细胞生长，抑制心肌细胞凋亡和心肌纤维化，并促新生血管、动员细胞和组织再生等，对缺血性心脏病有较好的治疗作用[13]。

HGF是一种强有力的生长因子，能够提高缺血心肌细胞的存活率[14]，Heeschen等[15]的研究显示，HGF水平增高急性冠脉综合征（ACS）患者较其水平低者恶性事件发生率降低，可预测ACS者危险事件的发生。 戚游等[16]发现血浆 HGF、TNF-α、IL-10的差异与青年脑梗死患者预后密切相关，并认为其可作为预测青年脑梗死预后的有意义指标。本实验通过对大鼠应用厄贝沙坦4周，观察到心肌组织缺血得到改善，并于术后24 h各组大鼠血中均检测到HGF含量，对照组及厄贝沙坦组大鼠HGF呈上升趋势，1周时HGF水平达到高峰，第2及4周时HGF水平均较1周时降低；1、2及4周厄贝沙坦组HGF水平均低于照组，4周时对HGF抑制作用更明显（P＜0.01）。此前笔者观察到厄贝沙坦对非ST段抬高心肌梗死 （NSTEMI）者血清HGF存在影响，治疗第7天两组患者血HGF明显高于治疗前（P＜0.05），但厄贝沙坦组明显低于对照组（P＜0.05）；两组患者治疗第14天时HGF水平均较治疗第7天下降（P＜0.05）。实验证实大鼠血HGF水平变化趋势及厄贝沙坦对其影响与人体观察结果一致。Liu等[7]研究发现Ad-HGF促进c-Kit+癌干细胞（CSC）增殖和分化使老龄大鼠AMI后心肌修复，可以推测AMI患者应用厄贝沙坦治疗，在早期可使心肌纤维化程度减轻，证实了早期使用厄贝沙坦对于心脏功能恢复的益处。

尽管当前在心肌梗死治疗领域取得了长足的进步，但其仍然是全球发病、高死亡率的主要原因[17]。心肌梗死后组织分子、细胞及间质发生改变，相互间关系复杂，共同促进心肌梗死后心室重构的发生、发展[18]。心肌梗死后常伴随梗死部位纤维化等病理变化，最终导致心功能恶化，已有研究证明RAAS在该过程中扮演重要角色[19]。HGF是血管内皮细胞特异的生长因子，在促进内皮细胞运动和形态改变方面具有重要的作用，并能促进血管新生和抑制凋亡，且参与了冠心病的发生和发展过程[20]。外周血中HGF细胞因子的水平变化可直接或间接反映心肌纤维化的病理生理过程[3]。但HGF的基因表达和作用机制非常精密和复杂，在疾病的不同阶段可能受不同的病理生理机制调节，厄贝沙坦能够影响心肌梗死后血中HGF水平，在两者之间是否存在其他细胞因子、信号通路共同参与其中，还不十分明确，尚需进一步研究探讨。该实验结果为厄贝沙坦治疗急性心肌梗死提供了新的治疗依据及研究方向。