48例原发性皮肤淀粉样变病OSMR基因突变检测

吴芳芳，吕 萍，薛汝增，梁云生，杨 斌,

原发性皮肤淀粉样变病(primary cutaneous amyloidosis, PCA) 是一种淀粉样物质沉积于皮肤组织中而其它器官均无受累的局限性疾病，病理主要表现为淀粉样物质沉积局限于真皮乳头层，临床上以典型的皮疹或组织病理活检及特殊染色来诊断。目前PCA的发病机制仍不清楚，多数学者认为是由多种因素相互作用共同导致疾病的发生，包括遗传因素、免疫因素、长期摩擦和日光照射等，但是不同种族人群的易感性及家族聚集现象表明基因因素可能在发病机制中起到重要的作用。目前关于PCA报道主要集中在家系患者[1]。该研究对48例PCA患者(主要是散发患者)的临床特点进行分析，并对OSMR基因的2～18号外显子进行PCR重测序，探讨OSMR基因突变与PCA临床特征之间的关系。

1 材料与方法

1.1病例资料

1.1.1病例来源 选取2016年6月～12月于广东省皮肤病医院门诊的48例PCA患者，纳入标准：所有入选患者被我院门诊医师明确诊断，即有典型的皮损且行皮肤组织活检术及特殊染色证实为PCA。

1.1.2年龄和性别 48例PCA患者中，家系患者17例(35.42%)，散发患者31例(64.58%)。发病年龄7～79(28.25±9.37)岁。其中，7～20岁11例，21～30岁17例，31～40岁15例，41～50岁5例。其中21～30岁为PCA患者发病的高发年龄段。男性患者21例，占43.75%；女性患者27例，占56.25%；男 ∶女为1 ∶1.3。

1.1.3临床表现及发病部位 43例患者为苔藓样淀粉样变病,苔藓型淀粉样变病是最常见的类型，临床表现为针头大小褐色斑疹，渐变为稍隆起丘疹，质硬，表面粗糙，有少许鳞屑(图1A)；4例患者为斑状淀粉样变病，临床表现为片状的褐色或紫褐色色素沉着，可融合形成特征性波纹状(图1B)；1例患者为皮肤异色病样淀粉样变病, 临床表现为弥漫性网状色素沉着基础上点状白班，无丘疹，皮肤萎缩及毛细血光扩张不明显(图1C)。48例PCA患者中有32例患者诉瘙痒，16例患者诉无瘙痒。皮肤瘙痒和丘疹是大部分PCA患者的主要症状和体征，组织病理提示表皮角化过度，真皮乳头层见嗜伊红均质物沉积，散在噬色素细胞，血管周围少许淋巴组织，甲基紫染色阳性(图2)。48例PCA患者受累部位如下：37例(77.08%)患者发生于小腿，该部位是最常见的发病部位,17例(35.42%)发生在大腿，27例(56.25%)发生在前臂，17例(35.42%)发生在上臂，25例(52.08%)发生在后背，5例(10.42%)发生在躯干。其中累及四肢及后背11例(22.92%)。

图1 皮肤淀粉样变病患者的临床表现

A：左下肢胫前见散在丘疹； B：左下肢弥漫性褐色色素沉着呈波纹状；C：躯干弥漫性色素沉着斑及点状色素减退斑

1.2实验方法

1.2.1外周血基因组DNA提取 采集所有患者外周血各5 ml，并采集52例非皮肤淀粉样变病患者和正常人外周血各5 ml。采用N96血液基因组DNA提出试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司，货号DP314]提取基因组DNA。

图2 皮肤淀粉样变病的组织病理 ×100

A：真皮乳头层见嗜伊红均质物沉积(HE 染色)；B：甲基紫染色阳性

1.2.2OSMR基因全部外显子的PCR扩增 由华大基因公司设计特异性引物17对(表1)。PCR反应体系：总体系30 μl，其中上下游引物各1 μl，模板DNA 2 μl，Taq PCR Master Mix 9.2 μl,双蒸水20.8 μl。PCR反应条件：96 ℃预变性5 min，96 ℃变性20 s，62～52 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共10个循环；96 ℃变性20 s，52 ℃退火30 s，72 ℃总延伸30 s,共35个循环；72 ℃总延伸2 min，1个循环；温度降至4 ℃终止反应。1.5%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物，PCR产物纯化及测序由北京华大基因完成。

表1 OSMR基因2～18外显子的PCR扩增引物序列

2 结果

2.1OSMR基因突变分析OSMR基因突变类型如下：48例PCA患者中24例患者发生OSMR基因突变，位于11外显子及15外显子。其中12例散发患者和9例家系患者为G513D点突变，该突变中第1538位碱基呈鸟嘌呤(G)代替了腺嘌呤(A)，使其编码的甘氨酸(Gly)被天冬氨酸(Asp)取代；1例散发患者和3例家系患者为P694L点突变，该突变中第2081位碱基呈胞嘧啶(C)代替了胸腺嘧啶(T),使其编码的脯氨酸(Pro)被亮氨酸(Leu)取代；2例家系患者为K697T点突变，该突变中第2090位碱基呈腺嘌呤(A)代替了胞嘧啶(C)，使其编码的赖氨酸被苏氨酸取代(图3)。同一家系中2个患者同时发生G513D和K697T点突变。OSMR基因其它外显子及52例非皮肤淀粉样变病患者和正常人未见突变。

2.2OSMR基因突变与临床特征之间的关系24例PCA突变患者中，21例为苔藓型，3例为斑状型；有瘙痒和无瘙痒OSMR基因突变率分别为56.25%、37.5%。17例家系患者中发现12例OSMR基因突变，突变率为70.59%；31例散发患者中发现13例OSMR基因突变，突变率为41.94%；家系患者OSMR基因突变率高于散发患者(χ2=3.989，P=0.046)。不同性别与OSMR基因突变差异无统计学意义(χ2=2.116，P=0.146)，有无瘙痒与OSMR基因突变差异无统计学意义(χ2=1.500，P=0.221)，不同年龄段与OSMR基因突变采用Fisher精确概率法统计分析，P双侧及单侧最小值分别为0.282和0.141，提示差异无统计学意义。

A：OSMR基因G513D正常基因型；B：OSMR基因G513D杂合突变(GGT→GAT)；C：OSMR基因G513D纯合突变(GGT→GAT)；D：OSMR基因P694L正常基因型；E：OSMR基因P694L杂合突变(CCG→CTG)；F：OSMR基因K697T正常基因型；G：OSMR基因K697T杂合突变(AAG→ACG)

3 讨论

PCA属于淀粉样变病的一种，系指淀粉样蛋白沉积于皮肤组织中而不累及其它器官的一种慢性皮肤病，在东南亚、中国、中东和南美洲较常见[2]。近年来的研究[1]显示家系PCA患者的致病基因位于染色体5 p13.1～q11.2，通过候选基因分析，发现错义突变在OSMR基因和IL31RA基因，这两个基因均属于IL-6家族细胞因子受体，OSMR编码的跨膜蛋白OSMRβ是OSMⅡ型受体和IL-31受体的组成部分，IL31RA编码的IL-31受体α与OSMRβ结合形成IL-31受体；利用家系PCA患者的皮损培养原代角质形成细胞，OSM细胞因子刺激后磷酸化的 JAK/STAT、MAPK及PI3K/Akt信号转导通路的活性降低[3]。散发PCA发病率相对家系PCA较高，但国内外大部分研究者主要研究家系PCA患者的OSMR基因的突变情况，散发患者OSMR基因突变研究较少，尤其是大陆中国人的基因突变情况[2-5]。本研究显示，PCA患者男女比例将近1 ∶1，平均发病年龄(28.25±9.368)岁，21～30岁为发病高峰年龄，这与国外人群的年龄分布类似[6]，但与国内研究[7]相比，本次纳入的48例患者的发病有年轻化趋势，这是否和环境因素改变有关，尚待进一步研究。本研究表明PCA最常见的类型是苔藓型，最常见的发病部位是双小腿，其次是前臂和后背，这与既往研究报道相一致。

迄今发现PCA相关的OSMR基因突变点共12个，均为错义变异且主要是家系患者，见表2。本研究中纳入一例皮肤异色病样淀粉样变病，未检测到OSMR基因突变，但可能存在其它位点的基因突变或样本量少，需要扩大样本量进一步验证。本研究48例患者中，结果显示OSMR基因3个错义突变分别为G513D、P694L、K697T，散发患者该基因的突变率可达41.94%，其突变位点位于G513D和P694L，主要集中在G513D位点(38.71%)。G513D位于胞外区的纤连蛋白Ⅲ-2结构域内，P694L、K697T位于胞外区的纤连蛋白Ⅲ-4结构域内，靠近OSMRβ的跨膜区。可知G513D位点突变既可以是显性突变也可以是隐性突变，这与以往报道[5]相一致。通过DNA质谱分析法对360例台湾人散发PCA的基因突变检测显示4个OSMR基因突变位点分别是V631L、I691T、P694L和K697T[8-12]，该研究在散发患者中基因突变率较低且未发现G513D位点的突变。

表2 原发性皮肤淀粉样变病OSMR基因突变位点汇总

OSMR基因突变与PCA的发病机制之间的关系目前尚不清楚。有研究[3]指出OSMR基因错义突变导致IL-31的信号转导异常。IL-31信号传导异常与瘙痒直接相关[13]。IL-31诱导单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)的分泌，在PCA皮肤中MCP-1表达降低；对PCA病理变化的影响可能是缺乏诱导的MCP-1导致在患者皮肤中减少单核细胞趋化性，从而导致先天免疫功能的改变，清除功能下降和细胞碎片的积累[14]。表皮神经支配增加可能是PCA瘙痒机制中的一部分；角质形成细胞的凋亡可能激活OSMβ或IL31RA突变，导致下游信号JAK/STAT、MAPK及PI3K/Akt通路的功能异常[15]。