激素受体阳性乳腺癌患者CYP2D6基因多态性及拷贝数变异与他莫昔芬治疗预后的相关性研究

李涌涛,齐新海,巴合提·哈立亚,张明帅,蒋威华,王晓文,甫拉提·吾瓦力汗

我国乳腺癌发病率呈现逐年上升趋势，已成为女性高发的恶性肿瘤，其中2/3以上的乳腺癌患者雌激素受体阳性，其发生发展与患者体内雌激素相关[1]。与此相对应，乳腺癌的内分泌治疗临床疗效确定、耐受性好，同时经济、便于患者持久服用，是乳腺癌的重要治疗手段。在激素敏感性乳腺癌的辅助治疗中，他莫昔芬在乳腺癌内分泌治疗领域一直占有主导地位，但是临床上约有30%～50%的乳腺癌患者对他莫昔芬发生耐药[2]，近年来，他莫昔芬药物代谢酶之一细胞色素氧化酶P450 2D6(cytochrome P450 2D6，CYP2D6)遗传多态变异对他莫昔芬的疗效及复发率和生存期具有明显相关性，该实验对不同结局的激素敏感性乳腺癌患者CYP2D6基因单核苷酸多态性和拷贝数变异情况进行研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1病例资料选取来自2008年1月～2012年12月在新疆医科大学附属肿瘤医院接受手术的乳腺癌患者，患者均有明确的乳腺癌病理诊断，均为浸润性乳腺癌，其激素受体阳性，且表达均在10%以上，人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)阳性的患者均接受曲妥珠单抗治疗1年，所有患者在化疗或放疗结束后口服他莫昔芬进行内分泌治疗。所有患者在进行内分泌治疗前(即接受规范化的化疗或放疗结束后)进行了相关的检查，无复发或转移的临床征象，所有患者服用他莫昔芬时间超过6个月。本研究通过新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会审查，所有患者签署知情同意书。共纳入253 例乳腺癌患者进行CYP2D6基因分型和拷贝数变异检测，这些患者均为女性，年龄28～67岁，其中汉族126例，维吾尔族78例，哈萨克族49例；病理类型浸润性导管癌239例，浸润性小叶癌12 例，髓样癌1 例，黏液癌1 例。患者相关临床病理资料见表1。

1.2乳腺癌预后的判定及分组局部复发是指在患侧乳腺或胸壁发现复发病灶，且均活检证实，同时将患侧所属区域经活检证实的肿大淋巴结也定位局部复发。转移是指非患侧所属区域经活检证实的肿大淋巴结，或远处器官，以活检病理结果作为诊断依据，不易再次病理活检的以前后影像学资料作为转移诊断依据。依据此标准入组的乳腺癌患者分为无复发转移组和复发转移组，各141例、112例。

1.3CYP2D6基因分型和拷贝数变异检测留取患者5 ml外周静脉血，保存在4 ℃的10 ml EDTA 抗凝管中。定期进行DNA 提取。对CYP2D6基因的编码区、外显子内含子拼接区进行PCR 扩增，引物序列依据条件和要求进行设定。总体积25 μl 的PCR反应体系包括以下成分：100 ng基因组DNA，15 mmol/L MgCl2，50 mmol/L KCl，10 /mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，200 μmol/L dNTPs，0.5 μmol/L 引物，0.2 μl TaqDNA聚合酶(5 U/μl)(美国Clontech公司)。PCR 反应条件：95 ℃ 5 min 预变性后，进行35个周期的循环(94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，最后一步72 ℃ 5 min)。

CYP2D6基因分型采用TaqMan实时荧光定量PCR技术。CYP2D6基因拷贝数测定采用上海天昊公司的AccuCopyTM多重基因拷贝数检测试剂盒进行检测。

1.4CYP2D6的等位基因及相应的代谢表型划分CYP2D6的等位基因与表型相关性参考人类细胞色素P450等位基因命名的信息委员会的网站(http://www.cypalleles.ki.se)。CYP2D6代谢表型的划分参考CPIC(Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium)关于药物基因组学的网站(https://www.pharmgkb.org)。依据CPIC指南将CYP2D6药物代谢表型分为：超快代谢型(ultrapid metabolizers，UM)、泛代谢型(extensive metabolizers，EM)、中间代谢型(intermedia metabolizers，IM)和弱代谢表型(poor metabolizers，PM)。

1.5统计学处理采用SPSS 17.0软件进行分析。本研究所有数据为计数资料，两组患者的基线特征比较、不同预后乳腺癌患者CYP2D6等位基因分布频率、代谢表型及拷贝数变异情况的比较均采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1患者临床病理特征及基线特征情况比较将两组患者的年龄、月经情况、民族、分期、Her-2情况、组织学分级进行比较，差异无统计学意义，基线特征基本一致。

2.2不同预后乳腺癌患者的CYP2D6等位基因多态性及拷贝数检测结果全部253例乳腺癌患者，无复发转移组有4例患者、复发转移组有2例患者血标本未检测到CYP2D6等位基因突变，即97.6%(247/253)的患者都检测到了CYP2D6等位基因多态性或拷贝数变异情况。CYP2D6基因多拷贝的发生率为14.3%(36/253)，其中功能型等位基因(*1、*2)多拷贝表达发生率约2.8%(7/253)。依据CPIC指南关于等位基因突变对CYP2D6酶活性的影响，将 CYP2D6的等位基因及相应的代谢表型划分PM、IM、EM、UM四型，无复发转移组与复发转移组患者PM型分别为0.73%(1/141)、1.82%(2/112)，IM型分别为10.22%(14/141)、12.73%(14/112)，EM型分别为83.94%(115/141)、85.45%(94/112)，UM型分别为5.11%(7/141)、0(0/112)。见表2。

表1 两组患者的基线特征情况比较(n)

2.3不同预后乳腺癌患者CYP2D6基因代谢表型的比较UM型CYP2D6代谢表型患者共7例，均为功能等位基因*1、*2多拷贝所致。无复发转移组与复发转移组乳腺癌患者CYP2D6代谢表型分布差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

但是分别将不同代谢表型在两组患者中的表达变异进行比较(表4)，结果显示无复发转移组有7例UM，而复发转移组未发现有UM，两组差异有统计学意义(P<0.05)。即存在功能等位基因*1、*2多拷贝的乳腺癌患者，在服用他莫昔芬治疗后，效果更好。

2.4不同预后乳腺癌患者CYP2D6基因拷贝数变异的比较CYP2D6基因除有单核苷酸多态性外，还存在拷贝数变异情况，因此又依据CYP2D6不同等位基因的拷贝数情况，对不同预后乳腺癌患者进行比较，结果见表5，可见不同预后两组乳腺癌患者CYP2D6 基因拷贝数变异的差异无统计学意义。

表2 不同预后乳腺癌患者的CYP2D6等位基因分型及代谢表型结果

表3 不同预后乳腺癌患者CYP2D6基因代谢表型的比较[n(%)]

表4 不同代谢表型在不同预后乳腺癌患者中的表达变异比较(n)

表5 不同预后乳腺癌患者CYP2D6基因拷贝数变异的比较

3 讨论

新疆作为西部欠发达地区，在激素敏感性乳腺癌的辅助治疗中，他莫昔芬由于经济、便于患者持久服用，在乳腺癌内分泌治疗领域一直占有主导地位。但是临床上约有30%～50%的乳腺癌患者对他莫昔芬发生耐药[3-4]。CYP2D6是细胞色素氧化酶P450酶系中的一个重要成员，是他莫昔芬在体内代谢的关键酶[5]，相关研究[6]显示其具有基因多态性，目前已经发现并命名了70多个等位基因。而CYP2D6基因遗传多态变异则很可能是导致他莫昔芬疗效及不良反应的内在因素。在本研究中，253例新疆地区激素受体阳性乳腺癌患者的CYP2D6基因单核苷酸多态性及拷贝数变异情况进行检测，97.6%(247/253)的患者都检测到了CYP2D6等位基因多态性或拷贝数变异情况。

在人体内，4-羟基他莫昔芬和4-羟-N-去甲基他莫昔芬与雌激素受体的亲和力显著高于他莫昔芬，是体内抗雌激素的主要活化成分[7]。在CYP2D6代谢酶的介导下，他莫昔芬和N-去甲基他莫昔芬形成4-羟基他莫昔芬和4-羟-N-去甲基他莫昔芬。依据CPIC关于CYP2D6药物代谢表型指南，将研究的乳腺癌患者分为UM、EM、IM和PM[8]。相关研究[9-10]显示，携带CYP2D6基因多拷贝的超快代谢型个体的4-羟基他莫昔芬和4-羟-N-去甲基他莫昔芬成分显著高于快代谢型及慢代谢型个体，这揭示超快代谢型个体用他莫昔芬治疗效果会更好。本研究显示预后好的无复发转移组，有7例UM，而复发转移组未发现有UM，两组差异有统计学意义(P<0.05)。这个结果显示存在功能等位基因*1、*2多拷贝的乳腺癌患者，在服用他莫昔芬治疗后，效果更好。这个结果与意大利的一项他莫昔芬预防试验[11]和德国的一项关于不同基因分型个体接受他莫昔芬治疗效果[12]的研究结论相一致。

CYP2D6基因突变发生的主要原因除了有单核苷酸变异(碱基的插入、删除或重组)，还存在拷贝数变异(copy number variations，CNVs)，即大片段基因的缺失以及基因的复制或扩增[13]。CYP2D6基因CNVs可以引起重要的代谢表型多态性。比如功能型等位基因(*1、*2)多拷贝表达可以引起酶的活性增加。相关研究[6]报道，在高加索人及亚洲人中，CYP2D6*1×2、CYP2D6*2×2的发生率约为0.5%～1.5%，而在非洲人群中约为1.6%～3.3%。在本研究中，CYP2D6基因多拷贝的发生率为14.3%(36/253)，其中功能型等位基因(*1、*2)多拷贝表达发生率约2.8%(7/253)，UM型CYP2D6代谢表型患者均为功能等位基因*1、*2多拷贝所致。将不同预后的乳腺癌患者分为两组，分别将这两组患者的拷贝数情况进行比较，差异无统计学意义。因为CYP2D6功能基因多拷贝变异发生率低，本研究样本例数相对较少，还需要更多样本量的试验去进一步的探索。

本研究结果提示，存在功能等位基因*1、*2多拷贝的乳腺癌超快代谢型患者，在服用他莫昔芬治疗后，效果更好。但CYP2D6功能基因多拷贝变异发生率低，需要更大的样本量去研究验证。CYP2D6基因的多态性及拷贝数变异情况在指导临床他莫昔芬用药、预测药物疗效等方面具有重要意义。后期还需要进一步的研究该基因的多态性及拷贝数变异情况，为他莫昔芬个体化治疗、提高治疗有效性和改善患者生存率提供理论依据。