虎杖提取白藜芦醇对PC-3细胞株的体外实验研究＊

胡著云 ，戈阳华 ，周琼 ，夏曙霞 ，徐庆刚 ，宫再兴 ，殷雍

(1、江西中医药大学附属医院，南昌 330006；2、南昌市第三医院，南昌 330009)

前列腺癌（PCa）的发病率位居所有男性恶性肿瘤的首位，且其死亡率位居男性恶性肿瘤的第2位，仅次于肺癌[1]。2015中国肿瘤登记年报显示，2011年中国前列腺癌的发病率位居所有恶性肿瘤的第9位，城市人群中前列腺癌的发病率和死亡率，在所有男性恶性肿瘤中排名第6位和第9位[2]。

白藜芦醇（3′，5′，4′-三羟基芪）是天然存在的多酚化合物，是中药虎杖的主要活性成分之一，其可通过激活或抑制信号通路、调解基因表达、诱导细胞周期延迟、细胞凋亡等方式作用于癌细胞，从而发挥抗肿瘤作用[3]。本研究对虎杖提取白藜芦醇诱导PC-3系细胞凋亡的作用及其机制进行研究，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 仪器与材料 Agilent 1260高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)，YP1002电子天平(上海越平科学仪器有限公司)，SQP型1/1万电子天平 (赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)，L-550台式低速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)。Leica DMIRB倒置相差显微镜 (OLYMPUS)，CO2培养箱（Sanyo，Japan），FAC Sort流式细胞仪(Becton Dickinson)，酶标仪，RPM I1640培养液(Gibcobrl公司)，PCR 提取及扩增试剂盒(Takara公司)。B iorad凝胶成像分析系统 (江苏捷达公司)。F12培养基（HyClone Company），胎牛血清（HyClone Company），胰蛋白酶(Difco)，噻唑蓝（Sigma），碘化丙啶(PI)，RNA 酶、TUNEL检测试剂盒 (武汉博士德公司)，蛋白酶K(ProteinaseK)，二氨基联苯(DAB)、多聚赖氨酸、二甲基亚砜DMSO （Sigma公司），白藜芦醇对照品(11535-200502，供含量测定用，20mg，中国药品生物制品检定所)。

1.2 试验药物提取 本研究选用中药虎杖产地为江西樟树，经江西中医药大学中药鉴定与炮制专家鉴定为廖科植物虎杖。采用醇提-树脂分离工艺提取药物中的白藜芦醇成分，并采用萃取和硅胶柱层析相结合的方法，最终得到含90%白藜芦醇的提取物[5]。

1.3 细胞培养 人前列腺癌PC-3细胞株购自中科院昆明细胞库，将其置于含10%新生牛血清的RPMI1640培养液中，常规二氧化碳培养箱培养、传代，直至细胞数量达到实验要求。

1.4 四甲基噻唑蓝（MTT）法检测细胞抑制率 选取第14-16代PC-3细胞，配成5×104个/ml细胞密度接种于96孔培养板，于37℃、5%CO2，饱和湿度条件下培养 24h后， 分别用25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的白藜芦醇干预 PC-3细胞 24、48和72h，同时设置对照组仅加入相应培养基。干预完成后，弃去培养基，加入200ml 5mg/m lMTT相同条件下继续培养4h后终止。吸弃上清液加入50ml DMSO处理，采用酶标仪测定OD 450nm时各孔细胞吸光值（OD），实验重复进行2次，然后计算抑制率。其中抑制率计算公式为（1-药物干预组OD/对照组 OD）×100%。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 备好生长状态良好的PC-3系细胞，其中生长范围为80%-90%，采用0.05%胰蛋白酶将其消化成单细胞悬液，随后培养于6cm皿中，密度为5×105个皿，时间为24h，此后分别加入浓度为 0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的白藜芦醇，继续培养24h后，充分稀释、洗涤后取1×106/m l的细胞待检测。将细胞重新悬浮，使其浓度为(2-5)×105/m l，加入 5μl Annexin V-FITC中。待3min后加入20μg/ml的碘化丙锭溶液 10μl，室温孵育，避光 10min后加入 300μl缓冲液，采用流式细胞仪进行检测和分析细胞凋亡情况。

1.6 Western blot法检测Bcl-2和Survivin蛋白的表达 将 25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L 白藜芦醇干预的PC-3细胞和对照组细胞进行裂解，BSA法检测总蛋白量。蛋白制备样本经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶100V恒压电泳分离，然后按照凝胶面积以0.65mA/cm2恒流电转移1.5h将蛋白自凝胶转印至PVDF膜。PVDF膜经5%脱脂奶粉室温封闭2h后，加入1∶1000稀释的一抗，4℃孵育过夜，封闭液漂洗后加入1∶2000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG二抗，室温孵育1.5h，漂洗后用ECL化学发光试剂盒增强发光，X线胶片显影。

1.7 统计学分析 采用SPSS 17.0软件分析数据。计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，以均数±标准差（x±s）表示。 P＜0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 不同浓度白藜芦醇对PC-3细胞抑制率比较随着白藜芦醇浓度的增高，PC-3细胞抑制率明显增加，各组间比较差异显著（P＜0.05）；同时随着时间的延长，PC-3细胞抑制率也明显增加，差异显著（P＜0.05）。 见表 1。

表1 不同浓度白藜芦醇对PC-3细胞抑制率比较（x±s，%）

2.2 不同浓度白藜芦醇对PC-3细胞凋亡的影响随着白藜芦醇浓度的增加，PC-3细胞凋亡率明显升高，具有明显的剂量依赖关系，呈剂量—效应关系(P＜0.05)。 见图 1。

2.3 不同浓度白藜芦醇对PC-3细胞中Bcl-2和Survivin蛋白表达的影响 随着白藜芦醇浓度的增加，PC-3细胞中Bcl-2和Survivin蛋白的平均光密度均明显下降，各组间比较差异显著（P＜0.05）。见表2。

图1 不同浓度白藜芦醇对PC-3细胞凋亡的影响

表2 各浓度白藜芦醇对PC-3细胞中Bcl-2和Survivin蛋白表达的影响（x±s）

3 讨论

肿瘤的发生、发展与细胞凋亡关系密切，其中凋亡抑制蛋白在前列腺癌的发生中起着极为重要的作用[5]。Bcl-2蛋白是细胞凋亡的关键调控者，同时也是第一个确认能对抗细胞凋亡的基因，其主要是通过线粒体外膜达到调节细胞凋亡的作用。相关研究显示，Bcl-2蛋白不仅与前列腺癌的发生有关，还与前列腺癌的临床病理特征有关。且Bcl-2蛋白的过表达促进了前列腺癌的发生和发展[6]。Survivin蛋白被证实是作用最强的凋亡抑制因子，其可参与细胞增殖分裂、细胞周期以及细胞凋亡的调控过程，具有调节细胞分裂和抑制细胞凋亡的双重功能，其在癌细胞中过度表达可能是肿瘤预后不良的一个因素[4]。且国外研究显示，前列腺癌中Survivin蛋白的表达与肿瘤的分期、分级密切相关，Survivin蛋白过表达会导致细胞加快向S期转换，抵抗G期抑制，从而促进细胞增殖[6]。同时，Survivin的组织分布有明显的选择性，其在正常成人组织中不表达，但在前列腺癌组织中呈现出高表达状态[6]。

基于此理论，针对凋亡抑制蛋白进行基因治疗可以促进前列腺肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖，同时又不影响正常组织，具有良好的靶向性、特异性和安全性[7]。为此寻找能有效干预细胞凋亡抑制蛋白的新型药物成为前列腺癌研究的关键。白藜芦醇属于非黄酮多酚类化合物，是中药虎杖的主要活性成分之一。药理学研究表明，其具有良好的抗肿瘤作用，抑制肿瘤转移、逆转肿瘤耐药、增强化疗药物药效、减少化疗不良反应等作用[8]。本研究将不同浓度的虎杖白藜芦醇对PC-3细胞进行体外实验，结果显示，PC-3细胞的增殖抑制、凋亡发生显著改变，说明白藜芦醇对前列腺癌细胞的增殖、凋亡可能具有调节作用。随着浓度的增加，白藜芦醇对前列腺癌PC-3细胞的抑制率逐渐增加，且呈现出时间-剂量依赖性，细胞的形态及增值情况差别显著。此外，随着白藜芦醇浓度的增加，PC-3细胞凋亡率明显升高，具有明显的剂量依赖关系。虎杖白藜芦醇有有效促进PC-3细胞凋亡，而通过Western blot提示，白藜芦醇能够抑制前列腺癌细胞Bcl-2和Survivin蛋白的表达，通过降低Bcl-2和Survivin蛋白的表达Bcl-2和Survivin蛋白的表达，从而促进细胞凋亡。因而本研究认白藜芦醇能够抑制前列腺癌细胞生长，其机制可能与白藜芦醇通过抑制Bcl-2和Survivin蛋白的表达而阻断信号通路有关。白藜芦醇抑制前列腺癌的具体作用机制仍需进行深入探讨，并需进行前列腺癌动物模型结合体内实验进行深入探讨，且白藜芦醇广泛存在于中草药及其他植物中，应提取不同植物的白藜芦醇进行实验研究，以便为将白藜芦醇作为预防或治疗前列腺癌的有效药物提供实验基础和最为充分的实验依据。