达氟沙星对猪胸膜肺炎放线杆菌的体外药效研究

王申森，徐士新

(中国兽医药品监察所，北京100081)

猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia，PCP)为现代养猪业危害重大的呼吸道细菌传染病之一。目前，国内外都未见达氟沙星对猪胸膜肺炎放线杆菌的折点值的报道[1]。本文对收集和分离到的48株猪胸膜肺炎放线杆菌进行了达氟沙星体外敏感性测试，以制订流行病学折点，指导临床治疗用药，并为该病的预防和控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 胰酪胨大豆琼脂培养基(161212)、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(150507)，购自北京陆桥技术股份有限公司。氧化型辅酶Ⅰ购自罗氏公司，灭菌超纯水配制为NAD储存液(10 mg/mL)备用。胎牛血清购自德国PAN Biotech公司。营养琼脂培养基、96孔药敏试验板(160722，含氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、磺胺异恶唑、复方新诺明、头孢噻呋、氟苯尼考、多西环素、庆大霉素、大观霉素、四环素、黏杆菌素、恩诺沙星、氧氟沙星)，购自天津市金章科技发展有限公司。甲磺酸达氟沙星对照品(H0201210)购自中国兽医药品监察所，用灭菌超纯水配制为达氟沙星储存液(1024 μg/mL)过膜备用。麦氏比浊仪购自梅里埃公司。

1.2 菌株来源 猪胸膜肺炎放线杆菌CVCC 3559、3560、3571、3572、3573、3574、3575、3576、3577、3578、3579、3580、3581、3581、3582、3583、3584、3585、3586、3587、3588、3589、3591、3592、3593、3594、3595、3599、3600购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，分离自传染性胸膜肺炎病猪肺。APP1-20菌株由河南省农业科学院畜牧兽医研究所惠赠，分离自病猪肺和气管。大肠杆菌ATCC 25922购自美国模式培养物研究所，由其实验室传代保存。

1.3 达氟沙星药敏板的制作 用微量加样器在无菌96孔板每孔内加入50 μL TSB培养基(含5%胎牛血清和0.1% NAD)。用微量加样器在无菌96孔板第1、3、5、7排第1孔中加入50 μL达氟沙星储存液，充分吹吸混匀后吸取50 μL至第2孔内吹吸混匀，用同样的方法依次稀释至第2、4、6、8排第10孔。此时每孔中达氟沙星浓度依次为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.01563、0.0078 μg/mL。

1.4 细菌培养 将保存的胸膜肺炎放线杆菌三区划线接种于TSA平板(含5%胎牛血清和0.1% NAD)，37 ℃培养18～24 h。ATCC 25922三区划线接种于营养琼脂培养基，37 ℃培养18～24 h。

1.5 生长曲线的绘制 取1支无菌圆底试管加入5 mL TSB培养基(含5%胎牛血清和0.1% NAD)，将过夜培养的CVCC 3594胸膜肺炎放线杆菌挑取单菌落于圆底试管中。将圆底试管置于37 ℃摇床，180 r/min培养。按照设定时间点0、1、2、4、6、8、15、24 h，取100 μL培养物用PBS溶液做一系列10倍梯度稀释后，均匀涂布于平板上，37 ℃孵育24 h后，选取菌落数30～300平板进行活菌菌落计数。

1.6 药敏试验 参考美国临床和实验室标准协会推荐的微量肉汤稀释法进行药敏试验和结果判定[2]。取5 mL无菌生理盐水，将受试菌浓度调至0.5麦氏比浊度。用微量加样器精密吸取100 μL菌悬液加至10 mL TSB培养基(含5%胎牛血清和0.1% NAD)，制成受试菌液。选择编号1～10菌株进行初步药物敏感性测试。无菌操作，在商品化药敏板每孔加入100 μL受试菌液，第8排11孔加入100 μL受试菌悬液作为阳性对照(有菌无药)，12孔加入100 μL TSB培养基作为阴性对照(无菌无药)。全部菌株进行达氟沙星药物敏感性测试。在自制达氟沙星药敏板每孔加入50 μL受试菌液，并设置阳性对照(有菌无药)和阴性对照(无菌无药)。每株受试菌做3组平行测定。选用大肠杆菌ATCC 25922为质控组菌株。整个96孔板加好受试菌液并盖上盖后，在工作台面缓慢螺旋推动使每孔内液体充分混匀，置于37 ℃生化培养箱培养18～24 h。在黑色桌面或白炽灯灯箱上观察结果并记录。

观察最小抑菌浓度试验结果后，取达氟沙星药敏板有药有菌无生长孔内的液体培养物100 μL接种于TSA平板上，置于37 ℃生化培养箱孵育24 h。无菌落生长平板所对应的达氟沙星药物浓度即为达氟沙星对受试菌的最小杀菌浓度(MBC)值。

1.7 达氟沙星杀菌曲线 选择CVCC 3594猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(达氟沙星MIC值为0.0078 μg/mL)作为体外杀菌研究对象。取无菌试管，用1 mL TSB培养基(5%胎牛血清和0.1% NAD)将达氟沙星稀释成一系列浓度梯度，依次为0、1、2、8、16、32、128 MIC。每支试管中依次加入1 mL菌悬液(2.0×106CFU/mL)。此时每支试管内达氟沙星浓度依次为0、0.5、1、2、4、8、64 MIC，菌液终浓度约为106CFU/mL。充分混匀后于37 ℃摇床培养。另取一支试管加入1 mL TSB培养基和1 mL无菌生理盐水作为空白对照。

按照设定时间点0、0.5、1、2、4、6、8、15、24 h，取100 μL培养物做梯度稀释后均匀涂布于平板上，置于37 ℃生化培养箱孵育24 h，选择菌落数为30～300个的平板进行活菌菌落计数。

2 结果与分析

2.1 生长曲线 按照设定时间点进行菌落计算，具体计数结果见表1。

表1 CVCC 3594菌落计数Tab 1 Counting on CVCC 3594 colonies

以时间(x)和该时间对应菌数的对数(y)绘制CVCC 3594的生长曲线(图1)。由生长曲线可知，在0～2 h左右处于生长迟缓期，2～8 h左右处于对数生长期，8～18 h以后处于稳定生长期。菌液振荡培养2～7 h可得对数生长期菌液，7～18 h可得稳定期菌液。试验时可根据需要控制生长时间获得不同生长状态的菌液。

2.2 药敏试验结果 有细菌生长时孔内液体呈弥散状浑浊或孔底有明显的圆形沉淀。无细菌生长时孔内液体清亮。无细菌生长孔所需药物最低浓度值即为该药对受试菌的最小抑菌浓度(MIC)值。ATCC 25922结果符合判定标准，说明试验操作和流程符合CLSI操作规范，结果可信。对氨苄西林、磺胺异恶唑、头孢噻呋、大观霉素、黏菌素耐药率高，表现出多重耐药。对阿莫西林/克拉维酸、复方新诺明、氟苯尼考、多西环素、庆大霉素、四环素、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星敏感。具体药敏结果见表2。

图1 CVCC 3594生长曲线Fig 1 Growth curve of CVCC 3594

抗菌药物判定标准/(μg·mL-1)试验结果/(株/%)耐药耐药敏感氨苄西林≥329(90)1(10)阿莫西林/克拉维酸≥160(0)10(100)磺胺异恶唑≥51210(100)0(0)复方新诺明≥40(0)10(100)头孢噻呋≥89(90)1(10)氟苯尼考≥160(0)10(100)多西环素≥160(0)10(100)庆大霉素≥160(0)10(100)大观霉素≥1287(70)3(30)四环素≥160(0)10(100)黏菌素≥46(60)4(40)恩诺沙星≥20(0)10(100)氧氟沙星≥80(0)10(100)达氟沙星≥80(0)10(100)

达氟沙星对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌最小抑菌浓度(MIC)分布如表3所示。

达氟沙星对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌最小杀菌浓度(MBC)分布如表4所示。

表3 达氟沙星最小抑菌浓度Tab 3 Minimal inhibit concentration of danofloxacin

表4 达氟沙星最小杀菌浓度Tab 4 Minimum bactericidal concentration of danofloxacin

图2 MIC值分布Fig 2 Data distribution of minimal inhibit concentration

本试验受试菌株有CVCC编号菌株28株和APP编号临床分离菌株20株。将CVCC编号菌株和APP编号菌株的药物敏感性试验结果进行对比。CVCC编号菌株因分离年代较久，大部分菌株对达氟沙星的保持较高的敏感性，MIC和MIB值集中于0.0078 μg/mL。APP编号临床菌株因为伴随着抗生素的使用，其对抗菌药物的敏感性和耐受性可能已经发生改变。分离菌株的MIC和MBC值分布不集中，且有6株菌的MIC值为4 μg/mL，8株菌的MBC值为4 μg/mL。说明临床猪传染性胸膜肺炎放线杆菌对达氟沙星的耐受已经增加，可能出现耐药风险(图2)。

2.3 达氟沙星体外杀菌曲线绘制 以时间(x)和该时间对应菌数的对数(y)绘制达氟沙星对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的杀菌曲线。由杀菌曲线可得，达氟沙星浓度在1MIC及以上时，随着浓度增加，杀灭全部细菌所用时间逐渐缩短，曲线明显左移。说明浓度增加导致杀菌速率加快。当达氟沙星浓度为0.5MIC时，可以维持一定的抑菌作用(图3)。

图3 达氟沙星杀菌曲线Fig 3 Killing curve of Danofloxacin on Actinobacillus pleuropneumoniae

3 讨论与结论

猪传染性胸膜肺炎在世界各地广泛分布，已经成为现代养猪业危害重大的呼吸道细菌传染病之一[3]。该病发病急、病程短、死亡率高，被认为是世界性工业化养猪的五大疫病之一，在我国多地呈流行趋势，已有20多个省份对该病进行报道。对其病原菌胸膜肺炎放线杆菌进行耐药性控制研究，可以为临床治疗猪传染性胸膜肺炎时使用药物提供理论依据，根据对不同药物的敏感性差异选择合适治疗药物，科学合理用药，为PK/PD折点的制定提供药理学研究数据。

在本次试验中，选择10株胸膜肺炎放线杆菌进行初步的药敏试验。结果表明猪传染性胸膜肺炎放线杆菌对氟苯尼考、四环素类和氟喹诺酮类药物具有敏感性；对氨苄西林、磺胺异恶唑、大观霉素等临床常用药物，已表现出耐药性。磺胺异恶唑、大观霉素等因为其抗菌谱广、毒副作用小、价格低等优点，在养殖业中常用来作为预防性药物使用[4]。长期不合理的使用导致微生物耐药性的产生或耐药基因的转移，以及临床菌株对药物的敏感性降低。张云峰等[5]从新疆地区分离到的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌对氨苄西林敏感，倪莉等[6]从重庆地区分离到的猪传染性胸膜肺炎对恩诺沙星和四环素类药物不敏感，与本次试验结论存在差异，这可能与发病地区抗菌药物使用程度有关。治疗时应筛选出流行地区的病原菌所敏感的药物进行针对性治疗，避免抗生素滥用。

根据初步药物敏感性试验结果，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌对氟喹诺酮类药物敏感。其中达氟沙星为动物专用药物，给药吸收后容易集中于肺部，且肺部药物浓度约为血药浓度的5～7倍，常用于治疗畜禽呼吸道疾病[7]。选择达氟沙星作为研究对象，进行其对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的体外药效学研究。杀菌动力学试验结果表明，当达氟沙星浓度在高于MIC时，随药物浓度增加，杀灭细菌所用时间逐渐缩短，是一种典型的浓度依赖型抗生素。在治疗用药时应合理设置给药剂量和给药间隔，使靶部位的药物浓度维持在MIC以上，保证抗感染治疗的效果。合理的给药方案应需要综合来自体外和体内研究的试验数据，本次试验可作为初步研究，提供数据基础。

将MIC分布制作直方图后观察是否存在野生型菌株和MIC异常偏高的菌株，通常低MIC的菌株相对更为敏感。根据野生型菌株MIC分部范围的上端，定义野生型临界值即流行病学折点[8]。本次试验受试菌株MIC值集中在两个区域，将较低的MIC范围上端0.5 μg/mL判定为药物敏感性折点。确定一种病原菌的流行病学折点至少需要100株该细菌的MIC数据，在今后的工作中应进一步收集有关试验参数，为折点的制定提供数据基础。目前关于折点数据已经有美国标准和欧盟标准，但折点标准受到时间、地域和用药的影响而有不同，我国也应根据我国国情加快制定适用的折点标准。

耐药性控制还需要兽药管理和监督部门加强抗生素药物的规范化管理，避免抗生素的滥用。临床兽医师进行治疗时应指导养殖人员对药物进行合理的使用，在保证治疗效果的同时控制药物使用剂量和给药间隔，降低耐药性菌株产生的风险，延长抗菌药物在临床的使用寿命，从而保证动物和人类的健康安全。