高效液相色谱法测定刺五加甘草颗粒中紫丁香苷的含量

姚路路，张 聪，潘贵珍，周德刚，田晓龙，张晓会

(1. 洛阳惠中兽药有限公司，洛阳 471000；2. 普莱柯生物工程股份有限公司，洛阳 471000)

刺五加为五加科植物刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr. et Maxim.) Harms的干燥根和根茎或茎，具有抗炎、提高机体免疫力、抗病毒、抗过敏等功效，刺五加多糖对鸡免疫功能具有显著的增强作用，其中紫丁香苷是刺五加的重要活性成分[1-2]。甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)为豆科植物甘草属的干燥根和根茎，甘草中的甘草酸具有抗炎、抗过敏、免疫调节、抗病毒等多种生物活性[3-4]，总黄酮有抗慢性不可预知应激抑郁作用[5]，多糖具有调节机体免疫等作用[6]。

刺五加甘草颗粒是由刺五加和甘草两味药材组成，采用水提醇沉法，上清液减压浓缩后，加入适量的辅料，制粒即得，可提高畜禽免疫力，用于鸡传染性支气管炎的治疗。

紫丁香苷作为刺五加的重要活性控制指标，文献中报道的刺五加中紫丁香苷含量测定主要为刺五加药材或刺五加单方制剂中紫丁香苷的含量测定[7-13]，对刺五加甘草颗粒中紫丁香苷的含量测定方法进行了相关研究，建立了刺五加甘草颗粒中紫丁香含量的高效液相色谱测定方法，可为刺五加甘草颗粒质量标准的建立提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂 Waters e2695高效液相色谱仪，配2489型紫外检测器，美国Waters公司；KQ-500超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司，AB135-S型电子分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；乙腈，HPLC级，MERK公司；水为超纯水。

1.2 试药 紫丁香苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111574-200603，含量：100%)、刺五加甘草颗粒(洛阳惠中兽药有限公司，批号：20170801，20170802，20170803，规格：每100 g相当于原生药160 g)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性 色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18(250 × 4.6 mm，5 μm)；梯度洗脱，流动相：乙腈-水(0 - 7 min，乙腈11%；7 - 8 min，乙腈由11%上升到40%；8 - 13 min，乙腈40%；13 - 14 min，乙腈由40%下降到11%；14 - 20 min，乙腈11%)，流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：265 nm；进样量：10 μL。理论板数按紫丁香苷峰计算应不低于5000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品贮备液的制备 取紫丁香苷对照品适量，精密称定，加甲醇制溶解制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密吸取对照品贮备液1 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品，研细，称取粉末约1.5 g，精密称定，置小烧杯中，用50%甲醇20 mL，分次溶解，转移至25 mL量瓶中，超声处理(功率250 W，频率50k Hz)30 min，取出，放冷，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方制备缺刺五加的阴性对照样品，按“2.2.3”项下方法制成阴性对照溶液，

2.3 专属性试验 分别取上述对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图(图1)。从图中可见，供试品溶液在与对照品色谱中紫丁香苷相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，阴性对照在紫丁香苷相应保留时间处无干扰峰。

2.4 线性试验 取“2.2.1”项下对照品贮备液，分别精密量取对照品贮备液适量，加甲醇稀释，制得浓度为0.01218，0.02030，0.04060，0.06090，0.08120 mg/mL的一系列溶液，分别精密吸取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以进样浓度(C，mg/mL)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：A=3×107C-13800，r=0.9999。表明紫丁香苷进样量在0.01218～0.08120 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 取对照品溶液(0.04060 mg/mL)，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，连续进样6针，记录峰面积，结果RSD为0.1%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取刺五加甘草颗粒(批号：20170801)，按照“2.2.3”项制备供试品溶液，分别制备6份，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，结果RSD为0.9%，表明方法重复性良好。

2.7 溶液稳定性试验 取刺五加甘草颗粒(批号：20170801)，按照“2.2.3”项制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h测定峰面积，结果RSD为0.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

1. 紫丁香苷对照品 2. 供试品 3. 阴性对照1. Reference Substance of Syringin 2. Test sample 3. negative control图1 专属性考察色谱图Fig 1 The chromatogram of Specific inspection

2.8 加样回收率试验 取已知含量的刺五加甘草颗粒样品6份(批号：20170801，紫丁香苷含量：0.738mg/g)，每份约0.8 g，精密称定，置小烧杯中，各精密加入0.1015 mg/mL的紫丁香苷对照品溶液5 mL，按照“2.2.3”项制备供试品溶液，按含量测定方法操作，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，测定样品含量并计算回收率，结果见表1，加样回收率在96.46%～99.53%之间，平均值为98.4%，RSD为1.2%，表明方法准确度良好。

2.9 耐用性试验 取刺五加甘草颗粒(批号：20170801)，按照“2.2.3”项制备供试品溶液，当柱温、流速发生微小变化以及使用不同型号的色谱柱，分别测定样品的峰面积，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表2。结果表明，当柱温、流速发生微小变化以及使用其他型号的色谱柱时，对含量测定结果基本无影响，表明方法耐用性良好。

表1 回收率试验结果Tab 1 The results of recovery test

表2 耐用性试验结果Tab 2 The results of durability test

2.10 三批样品含量测定 取刺五加甘草颗粒样品(20170801，20170802，20170803)，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算刺五加甘草颗粒中紫丁香苷的含量，三批样品测定结果见表3。

表3 样品含量测定结果Tab 2 The results of sample content determination

3 讨论与结论

3.1 检测波长的选择 通过紫外扫描，紫丁香苷在265 nm处有最大吸收，因此选择265 nm为检测波长。

3.2 提取溶剂及提取时间的选择 参考《中国兽药典》二部中刺五加药材及刺五加浸膏含量测定项下供试品的处理方法，比较了甲醇、75%甲醇、50%甲醇作为提取溶剂对紫丁香苷含量的影响，结果50%甲醇对紫丁香苷的提取效果最好，因此选择50%甲醇作为提取溶剂；同时考察了超声10、20、30 min对紫丁香苷含量的影响，结果超声30 min紫丁香苷的提取效果最好，因此选择超声30 min。

3.3 色谱条件的考察 本试验考察了甲醇-水(20∶80)、乙腈-水(11∶89)、乙腈-0.1%磷酸溶液，结果发现甲醇-水(20∶80)、乙腈-0.1%磷酸溶液条件下，阴性对照品在紫丁香苷对照品相应的保留时间处有干扰，乙腈-水(11∶89)条件下阴性对照品在紫丁香苷对照品相应的保留时间处无干扰，重复进样发现阴性对照品在紫丁香苷对照品相应保留时间处会有干扰，研究发现阴性对照品中干扰峰保留时间过长，在第二针色谱图中出峰，因此为确保阴性对照品中色谱峰能被完全洗脱，将流动相改为梯度洗脱，紫丁香苷的保留时间为8 min左右，与相邻峰分离度好，峰型良好。

采用高效液相色谱法测定刺五加甘草颗粒中紫丁香苷的含量，方法简便、准确度高、专属性强、重现性好。