蜘蛛香胶囊的质量标准研究

杨海峰，金礼琴，陈晓兰，李锋涛，李艳艳，吴 悦，李勇军*

(1.江苏农牧科技职业学院，泰州 225300；2. 江苏中牧倍康药业有限公司，泰州 225300)

蜘蛛香为败酱科植物蜘蛛香ValerianajatamansiJones的干燥根茎和根，其性味微苦、辛、温，归肺、脾、胃经，有理气止痛、消食止泻、祛风除湿之功效，主治肚腹胀痛、食积不化、腹泻痢疾、风湿痹痛[1-3]。蜘蛛香主要含有挥发油、黄酮类、环烯醚萜类和多糖等化学成分[4]。现代药理学研究表明，蜘蛛香提取物不仅具有镇静、催眠、镇痛、双向调节肠道蠕动等作用[5-7]，对细菌、病毒引起的肠炎也有较好的疗效[8-9]。蜘蛛香胶囊为蜘蛛香药材细粉制成的单方硬胶囊，于2017年1月获得国家三类新兽药证书，是目前国内获批的中药类宠物药品，主要用于防治犬细小病毒性肠炎。试验从性状、鉴别、检查、含量测定等方面开展了蜘蛛香胶囊的质量研究，建立了质量控制方法，为其临床应用的有效性和安全性提供了实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC20A型高效液相色谱仪，配备SPD-20A紫外检测器、LC-20AT双泵、HT-220A柱温箱，日本岛津公司产品；UV-2250型紫外可见分光光度计，日本岛津公司产品；AS1201型自动进样器，大连依利特公司产品；BT25S型电子天平，北京赛多利斯公司产品。

1.2 试药 蜘蛛香胶囊，规格0.25g/粒，批号分别为150826、150828、150830、150906、150908、150910，江苏中牧倍康药业有限公司提供；橙皮苷对照品，批号110721-201316，购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，水为自制纯化水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 性状 蜘蛛香胶囊为蜘蛛香药材细粉制成的硬胶囊，内容物为灰棕色或棕色的颗粒和粉末；气特异，味微苦、辛。

2.2 鉴别

2.2.1 显微鉴别 取蜘蛛香胶囊内容物，置显微镜下观察。显微鉴别特征明显，可见淀粉粒甚多，单粒类圆形、长圆形或卵形，有的一端尖突，直径5～39 μm，脐点裂缝状、三叉状或点状，有的可见层纹；复粒由2～4粒组成。导管主为网状导管和单纹孔导管。薄壁细胞内含有淡棕褐色物和橙皮苷结晶。

2.2.2 薄层色谱鉴别 取蜘蛛香胶囊内容物0.2 g，加乙醚5 mL，振摇，放置5 min，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加甲醇0.5 mL使溶解，作为供试品溶液。另取蜘蛛香对照药材0.2 g，同法制成对照药材溶液。吸取供试品溶液5 μL、对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚-丙酮(5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视。薄层色谱图见图1，可见斑点清晰，供试品、对照药材及对照品在相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，说明TLC法能鉴别出橙皮苷。

(1.橙皮苷对照品；2.蜘蛛香对照药材；3.蜘蛛香胶囊供试品)(1. reference substance of hesperidin；2. reference drug of Valeriana jatamansi Jones reference；3. ested sample of Valeriana jatamansi Jones capsule)图1 橙皮苷的薄层色谱图Fig 1 The TLC chromatogram of hesperidin

2.3 检查

2.3.1 水分 采用烘干法测定蜘蛛香胶囊的水分，准确称取3批次蜘蛛香胶囊内容物2 g，平铺于已干燥恒重的称量瓶中，精密称定，置105 ℃干燥至恒重。根据减失的重量，测得3批次蜘蛛香胶囊的水分含量分别为6.8%、7.1%、6.5%，均低于9%，符合规定。

2.3.2 装量差异 取蜘蛛香胶囊10粒，分别精密称定重量，倾出内容物，囊壳用小刷拭净，再分别精密称定囊壳重量，计算每粒内容物的装量与平均装量。3批次蜘蛛香胶囊的平均装量(n=10)分别为0.2503 g(RSD=2.7%)、0.2530 g(RSD=3.5%)、0.2515 g(RSD=2.4%)，装量差异在标示装量的±10%以内，符合规定。

2.3.3 崩解时限 取蜘蛛香胶囊6粒，采用升降式崩解仪测定其崩解时限。3批次蜘蛛香胶囊的崩解时间分别为15、16、15 min，均在30 min之内崩解，符合规定。

2.3.4 微生物限度 按照非无菌产品，采用微生物计数法和控制菌检查法进行微生物限度检查。供试液制备方法如下：取蜘蛛香胶囊内容物10 g置入灭菌研钵中，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液至20 mL，置45 ℃水浴中，振荡，使溶解，充分研磨，并在研磨过程中逐渐增加稀释液，直至供试品完全呈细匀状态为止，稀释液加入至总量为100 mL，作为1∶10的供试液。测定3批次蜘蛛香胶囊的细菌总数分别为74 cfu/g、67 cfu/g、61 cfu/g，霉菌和酵母菌总数分别为23 cfu/g、28 cfu/g、25 cfu/g，未检出大肠埃希菌，微生物限度检查结果符合规定。

2.4 含量测定

2.4.1 对照品溶液制备 精密称取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成质量浓度为40 μg/mL的溶液，即得。

2.4.2 供试品溶液制备 取蜘蛛香胶囊内容物，研细，分别取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.3 色谱条件 色谱柱：CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)；检测波长：284 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 缪L。在上述色谱条件下，橙皮苷与供试品溶液中的其他组分分离度良好，其保留时间在14.6 min左右，见图2。

2.4.4 线性关系考察 精密称取橙皮苷对照品20 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液0.5、1、2、5、10、20 mL，分别置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成8、16、32、80、160、320 g/mL系列浓度的对照品溶液。精密吸取上述不同浓度的对照品溶液20 μL，分别进样，测定峰面积。以峰面积(Y)对橙皮苷质量(X)进行线性回归，得回归方程Y=1906206.20X+102959.48(r=0.9999)，橙皮苷进样量在0.16～6.4 μg范围内与峰面积成良好的线性关系。

2.4.5 精密度试验 精密吸取20 μL同一橙皮苷对照品溶液，按“2.4.3”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，结果橙皮苷对照品溶液峰面积的RSD为0.43%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性试验 取蜘蛛香胶囊内容物约0.5 g，精密称定，按“2.4.2”项下制备供试品溶液，分别于配制后0、1、3、6、12、24 h，按“2.4.3”项下色谱条件进样测定，测定峰面积。结果同一供试品溶液在不同时间点所测得的橙皮苷峰面积的RSD为1.7%(n=6)，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.7 重复性试验 取同一批号的蜘蛛香胶囊内容物6份，每份约0.5 g，精密称定，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.4.3”项下色谱条件进样测定。测得同一批次蜘蛛香胶囊中橙皮苷的平均含量为2.11 mg/粒，RSD为1.9%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.4.8 加样回收率试验 取同一批号已知橙皮苷含量的蜘蛛香胶囊内容物6份，每份约0.5 g，精密称定，每份分别精密加入橙皮苷对照品溶液20 mL(0.2005 mg/mL)，按“2.4.2”项下制备供试品溶液，并按“2.4.3”项下色谱条件进样测定。加样回收率试验结果见表1，橙皮苷的平均回收率为97.7%，RSD为1.3%(n=6)，表明该方法准确性良好。

(A.橙皮苷对照品；B.蜘蛛香胶囊供试品；1. 橙皮苷)(A.reference substance of hesperidin; B. tested sample of Valeriana jatamansi Jones capsule; 1. hesperidin)图2 橙皮苷的高效液相色谱图Fig 2 The HPLC chromatogram of hesperidin

样品编号样品重量样品含量加入量测得总量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%10.50074.19524.018.165099.020.49974.19744.018.032395.630.50014.19284.018.121397.940.50054.20094.018.142798.350.50034.19334.018.157598.960.49954.19874.018.077396.797.71.3

2.4.9 样品含量测定 取不同批次的蜘蛛香胶囊内容物，每批取3份，每份约0.5 g，精密称定，按“2.4.2”项下制备供试品溶液，并按“2.4.3”项下色谱条件进样测定，测得峰面积，用外标法计算出橙皮苷含量，并换算成每粒蜘蛛香胶囊中所含的橙皮苷含量。6批次蜘蛛香胶囊的橙皮苷含量测定结果见表2，橙皮苷平均含量为2.08 mg/粒。

表2 蜘蛛香胶囊中橙皮苷的含量测定结果Tab 2 The determination of hesperidin in tested sample of Valeriana jatamansi Jones capsule

3 讨论与结论

目前中药质量控制的方法是其活性成分的定性与定量分析。橙皮苷(hesperidin)是蜘蛛香的主要化学成分之一，含量高，稳定性好，可作为蜘蛛香质量控制的监测指标。鉴别试验中，采用了兽药典普遍采用的显微鉴别和薄层色谱鉴别，其鉴别操作简单、特征明显，专属性强，重现性好。对水分、装量差异、崩解时限、微生物限度等检查项目进行方法验证和测定，检查结果均符合我国兽药典的相关规定。参考文献报道的蜘蛛香药材中橙皮苷HPLC检测方法[10-12]，分别选择了乙腈-0.1%磷酸溶液(15∶80)、乙腈：水(15∶85)、甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)、乙腈-2%醋酸溶液(18∶82)等几种不同组成及不同比例的流动相进行了考察，结果显示以甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)作为流动相获得的色谱峰峰形较好，橙皮苷的分离效果最好。

6个不同批次的蜘蛛香胶囊中橙皮苷(C28H34O15)的平均含量为2.08 mg/粒，考虑不同产地蜘蛛香药材中橙皮苷含量的差异，以含量测定值的80%作为含量下限，本品每粒含蜘蛛香以橙皮苷(C28H34O15)计，不得少于1.66 mg。综上所述，所建立的蜘蛛香胶囊质量控制方法专属性强、重复性好，能准确的进行定性和定量检测，可作为其生产、检验、使用和监管的技术依据。