仔泻康口服液的质量标准研究

雒利蓉，王 慧，崔东安，王富河，王胜义*

(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，兰州 730000；2.新疆农业大学动物医学院，乌鲁木齐 830000)

仔泻康口服液的研究是针对仔猪湿热性腹泻运用传统中兽医学理论，结合现代中药研究成果，通过药物筛选、科学组方研制出的中兽药制剂[1]。该方剂由黄芪、黄芩、黄连、白头翁、等药物组成，黄芪有入脾、肺经，补气升阳，固表止汗，托毒生肌，利水消肿的作用；黄芩有清热燥湿药，解热，镇静，利尿，缓解肠管痉挛等作用；黄连有清化湿热而固大肠的作用；白头翁有清热解毒，凉血止痢，专清大肠血热而治腹泻的作用。通过临床试验验证， 具有清热解毒，燥湿止痢等功效，且疗效显著。为了研究该制剂的质量，确定了黄芪、黄芩、黄连、白头翁的TLC鉴别方法；建立了HPLC测定仔泻康口服液中黄芩苷、盐酸小檗碱的含量测定方法。

1 材 料

1.1 仪器 SP-20E 型全自动点样仪购自上海科哲生化科技有限公司，Good See -20 E薄层色谱成像系统购自上海科哲生化科技有限公司，KH5200 型超声波清洗购自昆山禾创超声仪器有限公司，HHS-4型恒温水浴购自北京科伟永兴仪器有限公司，AL104 电子天平购自梅特勒-托利多有限公司，戴安U-3000购自戴安中国有限公司，超纯水制备仪购自利康有限公司，ME235S型微量分析天平购自Sartoriur公司，SapphireC18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)购自美国赛分科技有限公司，Thermo色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)购自美国安捷伦科技有限公司。

1.2 药品 仔泻康口服液由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所研制，每1 mL相当于原生药材1 g；黄芩苷标准品(批号：110715～201016)，盐酸小檗碱标准品(批号：110713 ～201212)、黄芪甲苷标准品(批号：110781～201616)、白头翁皂苷B4标准品(批号：160810)、黄芩苷对照药材(批号：120955～201309)、黄连对照药材(批号：120913～201310)、黄芪对照药材(批号：120974～201612)和白头翁对照药材(批号：160901)除白头翁对照药材和白头翁皂苷B4标准品购于北京北纳创联生物技术研究院，其余均购于中国食品药品检定研究院，硅胶GF254板购于青岛海洋化工厂；甲醇(Fisher Scientific，色谱纯)，乙腈(Fisher Scientific，色谱纯)，其他试剂均为分析纯。

2 方 法

2.1 黄芩TLC鉴别 取本品30 mL，加稀盐酸调pH至2，用醋酸乙酯震荡提取2次，每次40 mL，合并醋酸乙酯液，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；按处方比例，取除黄芩外的其他药味，按照供试品溶液制备工艺和前处理方法，制成阴性对照溶液；取黄芩对照药材1 g，加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)的混合溶液 60 mL，加热回流30 min，放冷，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，取上清液作为对照药材溶液。再取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄色层谱法(中国药典2015版一部附录ⅥB)试验[2]，吸取上述溶液各1 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以醋酸丁酯-甲酸-水(7∶4∶3)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液显色。

2.2 黄芪TLC鉴别 取本品30 mL，用以水饱和的正丁醇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液加1%氢氧化钠溶液洗涤2次，每次20 mL，取正丁醇液用以正丁醇饱和的水洗至中性。取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。按处方比例，取除黄芪外的其他药味，按照供试品溶液制备工艺和前处理方法，制成阴性对照溶液；取黄芪对照药材1 g，加甲醇30 mL，加热回流1 h，放冷，过滤，滤液蒸干，残渣加水30 mL使溶解，同法制成对照药材溶液。再取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2015版一部附录ⅥB)试验[2]，吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(13∶6∶2)10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。喷以10%的硫酸乙醇试液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。

2.3 黄连TLC鉴别 取样品15 mL，用三氯甲烷振摇提取2次，每次15 mL，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇1 mL，作为供试品溶液。按处方比例，取除黄连外的其他药味，按照供试品溶液制备工艺和前处理方法，制成阴性对照溶液；取对照药材0.5 mg，加水30 mL，煎煮2次，每次30 min，合并煎煮液，浓缩至近干，加甲醇2 mL使溶解，作为对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2015版一部附录ⅥB)试验[2]，分别吸取供试品溶液和阴性对照溶液各5 μL，对照药材和对照品溶液各1 μL，分别点于同一以羧甲基纤维钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)为展开剂，置氨蒸汽饱和的展开缸内，预饱和30 min，展开，取出，晾干，置365 nm紫外灯光下检视。

2.4 白头翁TLC鉴别 取本品15 mL，加70%乙醇30 mL，超声30 min，冷却，过滤。1500 r/min离心10 min，将上层清夜置蒸发皿中水浴挥干，放冷，残渣加甲醇1 mL使溶解，作供试品溶液。按处方比例，取除白头翁外的其他药味，按照供试品溶液制备工艺和前处理方法，制成阴性对照溶液；取白头翁对照药材1 g，加70%乙醇20 mL，超声30 min，冷却，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为对照药材溶液。再取白头翁皂苷B4对照品， 加甲醇制成每1 mL含1 mg 的溶液，作为对照品溶液备用。照薄层色谱法(中国药典2015版一部附录ⅥB)试验[2]，取上述各溶液10 μL，分别点于同一以羧甲基纤维钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿一甲醇一水(7∶3∶0.5)下层溶液为展开剂，预饱和10 min。展距为7.0 cm。取出，晾干，置于紫外光灯(365 nm)下检视，喷以10%硫酸水溶液，加热至显色。

2.5 黄芩苷含量的测定

2.5.1 色谱条件 Thermo色谱柱(4.6×250 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司)以甲醇-0.2%磷酸溶液(50∶50)为流动相[3-5]，流速1 mL/min，柱温30 ℃，检测波长276 nm。

2.5.2 样品溶液的制备 标准品：精确量取黄芩苷标准品6.25 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容，浓度为250 μg/mL，作为母液，分别量取母液1.25、2.5、3.75、5、6.25、7.5 mL置于25 mL容量瓶中，并用甲醇溶解作为标准品溶液。供试品：精确量取仔泻康口服液1 mL，至于25 mL容量瓶中，加适量甲醇，超声处理30 min，放置室温，加甲醇定容，振摇、静置，取上清微孔膜(0.45 um)滤过，取续滤液即得。阴性对照：取不含黄芩的处方药材，制备不含黄芩的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法配制阴性对照品溶液。

2.5.3 系统适应性试验 分别吸取仔泻康口服液、标准品溶液、阴性对照溶液各10 μL进样，并记录色谱峰。

2.5.4 线性关系考察 精密称取浓度为12.5、25、37.5、50、62.5、75 μg/mL的黄芩苷标准品溶液10 μL，按上述色谱条件注入色谱仪，测定峰面积。以黄芩苷进样含量X为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，回执标准曲线，求回归方程。

2.5.5 精密度试验 吸取浓度为25 μg/mL的标准品溶液10 μL，重复进样6次，记录峰面积，计算精密度RSD值。

2.5.6 重复性试验 精密称取样品 6份，每份1 mL，按仔泻康口服液供试品方法制备，各进样10 μL，检测并记录峰面积。

2.5.7 日间稳定性试验 精密称取样品 1 mL，按仔泻康口服液供试品方法制备，在制备后0、2、4、8、12、24 h各进样10 μL，测定峰面积。

2.5.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品6份，每份1 mL置于25 mL容量瓶中，精密加入已知浓度的黄芩苷溶液4 mL，按仔泻康口服液供试品制备，进样10 μL，测定峰面积，计算加样回收率。

2.5.9 样品测定试验 取样品3批，各批次取平行样品3份，按仔泻康口服液供试品方法制备，每份样品进样量10 μL，记录峰面积并计算出样品中黄芩苷的含量。

2.6 盐酸小檗碱含量的测定

2.6.1 色谱条件 SapphireC18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美国赛分科技有限公司)以乙腈-水(47∶53)(1000 mL水中含磷酸二氢钾3.4 g与十二烷基磺酸钠1.7 g)为流动相[6-8]，流速1 mL/min，柱温30 ℃，检测波长347 nm。

2.6.2 样品溶液的制备 标准品：精确量取盐酸小檗碱标准品625 μg，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容，浓度为25 μg/mL，作为标准品溶液。供试品：精确量取仔泻康口服液1 mL，至于25 mL容量瓶中，加适量甲醇，超声处理30 min，放置室温，加甲醇定容，振摇、静置，取上清微孔膜(0.45 μm)滤过，取续滤液即得。阴性对照：取不含黄连的处方药材，制备不含黄连的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法配制阴性对照品溶液。

2.6.3 系统适应性试验 分别吸取仔泻康口服液、标准品溶液、阴性对照溶液各10 μL进样，并记录色谱峰。

2.6.4 线性关系考察 精密称取浓度为25 μg/mL的盐酸小襞碱标准品溶液10 μL，按上述色谱条件注入色谱仪，测定峰面积。以盐酸小檗碱进样含量X为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，绘画标准曲线，求回归方程。

2.6.5 精密度试验 吸取浓度为25 μg/mL的标准品溶液10 μL，重复进样6次，记录峰面积，计算精密度RSD值。

2.6.6 重复性试验 精密称取样品 6份，每份1 mL，按仔泻康口服液供试品方法制备，各进样10 μL，检测并记录峰面积。

2.6.7 日间稳定性试验 精密称取样品 1 mL，按仔泻康口服液供试品方法制备，在制备后0、2、4、8、12、24 h各进样10 μL，测定峰面积。

2.6.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品6份，每份1 mL置于25 mL容量瓶中，精密加入已知浓度的盐酸小檗碱溶液1 mL，按仔泻康口服液供试品制备，进样10 μL，测定峰面积，计算加样回收率。

2.6.9 样品测定试验 取样品3批，各批次取平行样品3份，按仔泻康口服液供试品方法制备，每份样品进样量10 μL，记录峰面积并计算出样品中盐酸小檗碱的含量。

3 结果与分析

3.1 黄芩TLC鉴别 试验结果见图1，供试品色谱中，在与对照药材色谱、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，斑点清晰，阴性对照无相应的斑点，无干扰，方法具有专一性。

1.黄芩阴性；2.黄芩对照品；3.黄芩供试样品；4.黄芩对照药材图1 黄芩的TLC图谱Fig 1 TLC map of Radix scutellariae

3.2 黄芪TLC鉴别 试验结果见图2，供试品色谱中，在与对照药材色谱、黄芪甲苷对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，斑点清晰，阴性对照无相应的斑点，阴性对照无干扰，方法具有专一性。

1.黄芪阴性对照；2.黄芪对照品；3.黄芪供试样品；4.黄芪对照药材图2 黄芪的TLC图谱Fig 2 TLC map of Radix astragalos

3.3 黄连TLC鉴别 试验结果见图3，供试品色谱中， 在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与盐酸小檗碱对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，斑点清晰，阴性对照液无相应的斑点，阴性对照无干扰，方法具有专一性。

3.4 白头翁TLC鉴别 试验结果见图4，供试品色谱中，在与对照药材色谱、白头翁皂苷B4对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，斑点清晰，阴性对照无相应的斑点，阴性对照无干扰，方法具有专一性。

3.5 黄芩苷含量测定

3.5.1 系统适应性试验 样品中黄芩苷与相邻杂质峰分离良好，阴性对照在黄芩苷出峰时间无色谱峰，检测无干扰，如图5所示。

3.5.2 线性关系考察 黄芩苷线性回归直线回归方程：Y=1.6681X-2.4419，R2=0.9975(以黄芩苷进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标)。结果表明：黄芩苷峰面积与浓度在0.12～0.75 μg范围内呈现良好的线性关系。

3.5.3 精密度试验 仔泻康口服液中黄芩苷含量的RSD为1.37%(n=6)，表明仪器精密度良好，如表1所示。

1.黄连对照品；2.黄连对照药材；3.黄连供试样品；4.黄连阴性对照图3 黄连的TLC图谱Fig 3 TLC map of Rhizoma coptidis

1.白头翁阴性对照；2.白头翁供试样品；3.白头翁阴性；4.白头翁供试样品；5.白头翁对照药材；6.白头翁对照品图4 白头翁的TLC图谱Fig 4 TLC map of Radix puLsatillae

A.黄芩苷对照品 B.仔泻康口服液阴性供试品 C.仔泻康口服液供试品 图5 黄芩苷的HPLC色谱图Fig 5 HPLC chromatogram map of Baicalin

图6 黄芩苷线性关系图Fig 6 Calibration cure of baicalin

编号峰面积RSD/%113.0443213.0317312.9509412.9648512.6517612.67631.37

3.5.4 重复性试验 仔泻康口服液中测定的黄芩苷含量结果如表2所示，黄芩苷峰面积RSD值为2.74%，表明该检测方法重复性良好。

表2 黄芩苷重复性试验结果表Tab 2 Results of reproducibility test of baicalin

3.5.5 日间稳定性试验 仔泻康口服液在制备后0，2，4，8，12，24分别测定黄芩苷，黄芩苷峰面积RSD值为0.54%，表明黄芩苷在仔泻康口服液中具有良好的稳定性，结果如表3所示。

3.5.6 加样回收率试验 6份已知黄芩苷含量的样品加样回收率测定结果如表4，平均回收率97 %，RSD为2.3 %。

表3 黄芩苷日间稳定性试验结果表Tab 3 Results of stability test of baicalin

3.5.7 样品测定试验 经上述方法测定，第一批黄芩苷的平均含量为3.489 mg/mL，第二批黄芩苷的平均含量为3.570 mg/mL，第三批黄芩苷的平均含量为3.510 mg/mL，RSD=1.19 %，说明不同批号的仔泻康口服液中黄芩苷的含量稳定。

3.6 盐酸小檗碱含量测定

3.6.1 系统适应性试验 样品中盐酸小檗碱与相邻杂质峰分离良好，阴性对照在盐酸小檗碱出峰时间无色谱峰，检测无干扰，如图7所示。

表4 黄芩苷加样回收率试验结果表Tab 4 Results cosfficient of recovery test of baicalin

表5 黄芩苷含量测定结果表Tab 5 Contents of baicalin

3.6.2 线性关系考察 盐酸小檗碱线性回归直线回归方程：Y=1.7058X-1.9246，R2=0.9929(以盐酸小檗碱进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标)。结果表明：盐酸小檗碱峰面积与浓度在0.125～0.75 μg范围内呈现良好的线性关系。

A.盐酸小檗碱对照品 B.仔泻康口服液供试品 C.仔泻康口服液阴性供试品图7 盐酸小檗碱HPLC色谱图Fig 7 HPLC chromatogram map of Berberine hydrochloride

图8 盐酸小檗碱线性关系图Fig 8 Calibration cure of berberine hydrochloride

3.6.3 精密度试验 仔泻康口服液中盐酸小檗碱含量的RSD为0.12 %(n=6)，表明仪器精密度良好，如表6所示。

表6 盐酸小檗碱精密度试验结果表Tab 6 Results of precision test of berberine hydrochloride

3.6.4 重复性试验 仔泻康口服液中测定的盐酸小檗碱含量结果如表7所示，盐酸小檗碱峰面积RSD值为1.05 %，表明该检测方法重复性良好。

表7 盐酸小檗碱重复性试验结果表Tab 7 Results of reproducibility test of berberin hydrochloride

3.6.5 日间稳定性试验 仔泻康口服液在制备后0、2、4、8、12、24 h分别测定盐酸小檗碱，盐酸小檗碱峰面积RSD值为0.56 %，表明盐酸小檗碱在仔泻康口服液中具有良好的稳定性，结果如表8所示。

表8 盐酸小檗碱日间稳定性试验结果表Tab 8 Results of stability test of berberin hydrochloride

3.6.6 加样回收率试验 6份已知盐酸小檗碱含量的样品加样回收率测定结果如表9，平均回收率93.33 %，RSD为2.21 %。

表9 盐酸小檗碱加样回收率试验结果表Tab 9 Results cosfficient of recovery test of berberin hydrochloride

3.6.7 样品测定试验 经上述方法测定，第一批盐酸小檗碱的平均含量为1.556 mg/mL，第二批盐酸小檗碱的平均含量为1.503 mg/mL，第三批盐酸小檗碱的平均含量为1.488 mg/mL，RSD=2.4 %，说明不同批号的仔泻康口服液中盐酸小檗碱的含量稳定。

表10 盐酸小檗碱含量测定结果表Tab 10 Contents of berberin hydrochloride

4 讨论与结论

在白头翁皂苷b4鉴别研究中，同时参考中国药典(2015版一部附录ⅥB)和中国兽药典委员会(2010)方法[9]，两者相比，以中国兽药典委员会(2010)的展开剂正丁醇-醋酸-水(4∶1∶2)展开后显色，此方法分离度差，杂质多，超载严重，出现大斑点，此斑点会使白头翁皂苷B4位置的斑点模糊，影响结果的观察，而中国药典(2015版一部附录ⅥB)以氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.5)下层溶液为展开剂，预饱和10 min，可以得到良好清晰的斑点并且简单易便。

在盐酸小檗碱鉴别研究中，当展开剂以苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨溶液(12∶6∶3∶3∶1)，分层效果虽然很好，但是苯时毒性物质，挥发快，易在空气中扩散，对人危害性很大，不建议用此方法去定性鉴别黄连，当展开剂以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)为展开剂，置氨蒸汽饱和的展开缸内熏蒸，熏蒸时间不够，分层不好，并且当板全跑时，供试品溶液与对照品相应的位置的荧光斑点有些虚，一般跑到离边缘3 cm左右时，效果较理想。

在黄芩苷鉴别研究中，对仔泻康口服液样品进行提取时，为了避免有效成分的损失，直接加甲醇溶解，结果是干扰成分太多，效果不太理想。而用一定量的乙酸乙酯萃取，过滤，结果斑点清晰，此萃取方法为仔泻康口服液的质量控制提供了有效、可靠的检测方法，也为水煎合剂中黄芩的薄层鉴别提供了借鉴。

在黄芪甲苷鉴别研究中，因黄芪甲苷在正丁醇中有一定的溶解度，而仔泻康口服液中其他成分在正丁醇中溶解度很小，故用正丁醇对供试品进行萃取，这样能除去一部分杂质而富集黄芪甲苷的含量，展开后的黄芪甲苷对照斑点清晰，阴性无干扰，效果较理想；同时也尝试用乙醇对供试品进行萃取，结果发现，乙醇的萃取效果没有正丁醇的好[10]，当放置时间长后，黄芪甲苷就会析出，不利于点样。

采用高效液相色谱法测定仔泻康口服液中的黄芩苷和盐酸小檗碱的含量，精密度高，分离度好，重现性好，保留时间适中，阴性无干扰，但是在黄芩苷样品标准品中出现两个峰，除标准峰以外的峰此峰经试验验证是溶剂峰，并对标准峰无干扰现象，因此，通过黄连、黄芪、黄芩、白头翁的定性鉴别及黄芩苷和盐酸小檗碱的含量测定，能够达到控制仔泻康口服液质量控制的目的，为新药的研究提供试验资料。