LAMP技术在涂阴肺结核中的临床快速诊断价值

陈伊 黄文焰

深圳市宝安区慢性病防治院（广东深圳 518102）

结核病是结核分枝杆菌感染引起的一种慢性传染病，目前我国结核病的患病率形势不容乐观并呈现地区不平衡性［1］。涂阴肺结核由于痰涂片阴性，在现有的基层诊疗机构的常规结核诊断技术下，容易造成误诊漏诊的情况发生，延误患者的治疗，因此如何更加准确、快速、简便地诊断涂阴肺结核对于结核病的防治工作具有重要意义。

环介导等温扩增技术（loop⁃mediated isothermal amplification，LAMP）是由 NOTOMI［2］等在 2010 年创建，是一种新型核酸检测技术，该技术最大的特点是不需要像传统的PCR技术一样变温扩增，只需在恒温条件（60～65℃）下就可完成反应，并且结果可以目测判断。现今LAMP技术在结核病的诊断应用方面也已有相关研究［3-9］并显示出良好的临床效能。2016年世界卫生组织推荐该技术用于有肺结核临床症状和体征的成人［10］。

GeneXpert MTB/RIF检测系统是一种以半巢式实时定量PCR为技术基础的全自动结核分枝杆菌检测系统，能同时检测结核分枝杆菌及利福平耐药并在2 h内完成，具有快速，准确，操作简单等优点。世界卫生组织已批准GeneXpert MTB/RIF用于结核分枝杆菌及多重耐药结核分枝杆菌的快速诊断。国内外也已有应用GeneXpert MTB/RIF检测系统的临床研究［11-13］。

本研究通过应用LAMP法对临床确诊为肺结核的患者和非结核患者进行结核分枝杆菌的检测，并同时与痰涂片法进行对比分析，来评估其在肺结核尤其是涂阴肺结核中的诊断价值。传统结核分枝杆菌PCR检测技术作为一种快速检测技术，需要PCR实验室，考虑到现有基层结核诊疗机构的设施现状，以及目前同样作为快速诊断技术的GeneXpert MTB/RIF全自动检测系统不需要如此严格的实验场地及人员素质要求的优势，本研究采用GeneXpert MTB/RIF全自动检测系统，来对比分析LAMP技术，以此评估LAMP技术在涂阴肺结核快速诊断方面的临床价值及优点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2016～2017年本院临床诊断为肺结核的患者170例，非结核患者100例，本次入选研究对象在16～61岁之间。

1.2 仪器与试剂 lamp法检测试剂盒由广州迪澳生物科技有限公司提供；GeneXpert MTB/RIF检测试剂盒由美国Cepheid公司提供；仪器：恒温扩增仪由广州迪澳生物科技有限公司提供；Gene Xpert仪器由美国Cepheid公司提供。

1.3 质控菌株 结核分枝杆菌H37Rv来自深圳市慢性病防治中心，大肠埃希菌由本院提供。

1.4 方法 对入选的所有痰标本进行lamp法、痰涂片抗酸染色法以及GeneXpert MTB/RIF检测。

1.4.1 LAMP技术 按照产品说明书操作。每批次样本检测的同时行阴阳性对照及质控。

1.4.1.1 样本处理 将痰样本中加入等体积的4%NaOH溶液，涡旋振荡混匀，室温静置15 min，吸取1 mL加入离心管中，12 000 r/min（离心半径25 mm）离心5 min，去上清，加入1 m L 0.9%NaCL混匀，12 000 r/min（离心半径25 mm）离心5 min，去上清，加入100 μL DNA提取液混匀，100℃加热10 min后迅速冷却，12 000 r/min（离心半径25 mm）离心2 min，取2 μL上清液用于核酸扩增。

1.4.1.2 加样扩增 在含22 μL反应液及1 μL Bst聚合酶的PCR反应管中加入20 μL密封液并将2 μL模板加入密封液面以下，10 000 r/min（离心半径25 mm）离心5 s，放入恒温扩增仪中，63℃扩增45 min。

1.4.1.3 结果判定 扩增曲线呈“S”型曲线，判断为阳性，含有结核分枝杆菌复合群；扩增曲线呈一条直线或倾斜直线，判断为阴性，不含有结核分枝杆菌复合群或低于检测限（1×102/mL）。

1.4.2 GeneXpert MTB/RIF 操作及判读严格按说明书进行检测。根据痰液标本的性状，加入合适体积的标本处理液，一般为痰液体积的两倍，摇动数次，并静置10～15 min，待痰液全部溶解，吸取2 mL全部溶解的痰液至GeneXpert MTB/RIF反应试剂盒，注意不要产生气泡，将反应盒放入Gene Xpert仪器检测，不可将反应盒颠倒摇晃。

1.4.3 痰涂片抗酸染色法 按照《中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》操作。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0进行统计分析，对计量资料采用百分比和描述，方法间配对计数资料的比较采用McNemar检验和Kappa一致性检验。率的比较采用χ2检验。χ2检验及McNemar检验以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LAMP技术与痰涂片抗酸染色比较 在170例肺结核患者组中，LAMP法检出83例阳性，阳性率为48.8%，痰涂片抗酸染色检出60例阳性，阳性率35.2%。两种方法一致性分析，两者一致性一般（κ=0.680）。McNemar检验分析显示，两方法差异有统计学意义（P＜0.05）。在肺结核患者组LAMP法敏感性高于痰涂片抗酸染色法，阳性率约13%的差异。见表1。LAMP法恒温扩增曲线图见图1。

图1 LAMP法恒温扩增曲线图Fig.1 Graph of isothermal amplification curve using LAMP

表1 三种检测方法的比较Tab.1 Comparison of three detection methods

2.2 LAMP法在涂阴肺结核、涂阳肺结核及非结核患者中的比较 根据痰涂片抗酸染色的结果，将肺结核患者组分为涂阴及涂阳肺结核两组进行分析。LAMP法在肺结核组与非结核组的阳性检出率比较，差异有统计学意义（χ2=60.908，P＜0.05）。110例涂阴肺结核患者中，LAMP检出阳性26例；60例涂阳肺结核患者中，LAMP检出阳性57例；100例非结核患者中，LAMP检出阳性3例。LAMP法在涂阴肺结核患者、涂阳肺结核患者及非结核患者中的阳性率分别为23.6%（26/110）、95.0%（57/60）、3.0%（3/100）。将涂阴肺结核与涂阳肺结核组的阳性检出率比较，两组的阳性检出率差异有统计学意义（χ2=79.132，P＜0.05）。涂阴肺结核组与非结核组的阳性检出率比较，两组的阳性检出率差异有统计学意义（χ2=18.741，P＜0.05）。涂阳肺结核组与非结核患者组的阳性检出率比较，两组的阳性检出率差异有统计学意义（χ2=135.4，P＜0.05）。LAMP技术在涂阳肺结核患者组的阳性率最高。见表2。

2.3 GeneXpert MTB/RIF技术分析 GeneXpertMTB/RIF在肺结核患者组中检出阳性89例，其阳性率为52.4%（89/170），其在肺结核组与非结核组的阳性检出率比较，差异有统计学意义（χ2=78.096，P＜ 0.05）。

表2 LAMP法和GeneXpert MTB/RIF检测结果比较Tab.2 Comparison of LAMP and GeneXpert MTB/RIF Test Results

2.4 LAMP法与GeneXpert MTB/RIF技术比较两方法在肺结核患者组的阳性率分别为48.8及52.4%，见表1。两种方法一致性分析，两者一致性最佳（κ=0.906）。McNemar检验分析显示，两方法阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）。在110例涂阴肺结核患者组中，以Xpert MTB/RIF技术为标准，LAMP法的敏感度为82.8%（24/29）、特异度为97.5%（79/81），总体一致率93.6%（103/110）。两种方法一致性分析，两者一致性最佳（κ=0.879）。McNemar检验分析显示，两方法阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

3 讨论

目前由于多重耐药结核的增加以及HIV合并感染的出现等一系列的原因，结核病已成为全球性的公共卫生难题，在我国结核病的就诊人群以肺结核患者居多［1］。疑似肺结核的患者如若抗酸染色痰涂片检测阴性，在基层诊疗机构中，临床往往需要结合痰培养结果以及诊断性治疗的情况等才能判断是否为结核病，但作为金标准的罗氏培养法通常需要4～8周的时间，耗时长，敏感度较低，这无疑会增加人群感染的风险以及延误患者的治疗，因此简单快速，高效价廉的结核检测技术对于涂阴肺结核的诊断具有重要意义。

抗酸染色痰涂片法阳性检出率受痰标本质量，取样时间以及排菌量等的影响较大，灵敏度较低。LAMP技术通过高效DNA聚合酶识别目标基因，在恒温状态扩增45 min即可完成反应，全过程只需2 h完成，在时间和设备上充分满足了临床检测需要，特别是对于基层诊疗机构而言，具有巨大优势。本研究结果显示LAMP法与痰涂片抗酸染色法相比，LAMP法在肺结核组中的阳性检出率高，高出约13%。有研究［6］显示，LAMP法在诊断结核病方面表现优于常规涂片镜检，这与本研究一致。LAMP法在涂阳肺结核患者组的阳性率为95.0%，与涂阴肺结核患者中的阳性检出率为23.6%相比，LAMP法在涂阳肺结核患者组的敏感性更高。国外研究显示，LAMP法在涂阳肺结核的阳性率为92.0%，在涂阴肺结核的检测中，涂阴比涂阳的阳性率低，这与本研究结果相近［9］。LAMP法在涂阳涂阴肺结核患者组的阳性率差别，可能是由于患者痰标本中结核分枝杆菌的量不同造成。抗酸染色痰涂片法不能区分结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌，调查显示，非结核分枝杆菌感染在疑似结核的就诊人群占有一定的比例［14］，应用LAMP法技术可以在2 h内区分出痰标本中是结核分枝杆菌还是非结核分枝杆菌，减少了医疗差错的发生，这有利于临床作出正确的诊断及制定治疗方案。本次研究中痰涂片抗酸染色阳性而LAMP法检测阴性的样本有可能是由非结核分枝杆菌感染所致。对于临床常规开展的结核病检验项目抗酸染色痰涂片法而言，其需要具有专业经验的人员进行镜检，效率低，而LAMP法操作简单，易于批量操作，便于准确而及时的出具检验结果。

GeneXpert MTB/RIF是近年来世界卫生组织批准推荐的结核分枝杆菌快速检测技术，其不但可以快速检测结核分枝杆菌而且可以检测利福平耐药，本研究将LAMP技术与GeneXpert MTB/RIF这一种近年来应用的结核分枝杆菌快速检测技进行比较，以此评估LAMP技术的效能。有研究显示GeneXpert MTB/RIF在涂阳结核患者中的诊断性高于涂阴结核患者，其在涂阴肺结核的诊断上也有很好的临床价值［15-16］，这与本研究结果一致。LAMP技术和GeneXpert MTB/RIF技术检测涂阴肺结核患者组的阳性检出率分别为23.6%和26.4%，两者的阳性检出率差异无统计学意义，一致性分析最佳，这表明两种方法在涂阴肺结核中的诊断效能一致。REDDY等［7］研究数据显示LAMP技术比GeneXpert MTB/RIF的敏感性高，本研究结果显示，LAMP技术在肺结核组的检出率与GeneXpert MTB/RIF无差异，这可能是人群差异造成。有研究表明痰标本质量对GeneXpert MTB/RIF具有影响［17］，因此痰标本质量也可能引起上述结果。

LAMP技术优点与局限性：LAMP技术操作简单、不需要系统专业的培训、用时少、生物安全性高，与GeneXpert MTB/RIF相比检测费用较低，设备环境要求较低，但其不能区分死菌和活菌，且不能像GeneXpert MTB/RIF一样在检测结核分枝杆菌的同时检测耐药，这在一定程度上影响了其临床应用。

综上所述，LAMP技术在涂阴肺结核痰标本快速检测方面具有良好的诊断效能，具有较好的临床应用价值和应用前景。