多囊卵巢综合征卵泡液代谢轮廓分析及对IVF⁃ET妊娠结局的影响

曾伟宏 李子涛 陈创奇 梁嘉颖 欧阳海梅 梁金群 谢汛杰 陈暖 江剑辉

广东省妇幼保健院（广州 511442）

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS），尤其是难治性PCOS患者，在进行IVF⁃ET时高雄激素易发生卵巢过度刺激综合征，存在卵细胞质量下降，受精率降低等难点问题。近年来随着代谢组学的兴起，逐渐成为生命科学研究热点，并有效应用于IVF⁃ET中，尤其是卵泡液代谢组学的研究越来越受到重视。研究表明卵泡液相关代谢物如糖类、激素等可预测卵母细胞发育潜能，而PCOS患者内分泌疾病机体内环境改变直接或间接影响卵泡液微环境，使其物质组成和代谢水平变得更复杂更多样性。因此，本研究通过质谱代谢组学分析，对PCOS和对照组的卵泡液进行全面的氨基酸、脂肪酸、有机酸代谢物定性和定量分析，寻找差异性代谢产物，进一步完善PCOS卵泡液代谢谱，为改善卵母细细质量、优化卵子培养液提供可靠依据，为探讨胚胎发育潜能和提高妊娠率提供早期、无创、准确可靠的方法。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选自2016年7月至2017年8月期间广东省妇幼保健院生殖健康与不孕症中心确诊的PCOS患者80例，年龄22～42岁，平均（28.5±4.5）岁。因输卵管因素或男方因素致女性不孕者为正常对照组85例，年龄24～39岁，平均（29.0±5.3）岁。多囊卵巢综合征入选标准及排除标准参照2003年欧洲人类生殖和胚胎学会与美国生殖医学学会颁布的鹿特丹标准［1］：（1）稀发排卵或无排卵；（2）高雄激素血症或高雄激素的临床表现（如多毛、痤疮等）；（3）超声表现为卵巢多囊样改变：一侧或双侧卵巢直径2～9 mm的卵泡数≥12个，或（和）卵巢体积≥10 mL。符合上述3条中的2条，同时排除：（1）高雄激素血症的其他原因；（2）高泌乳素血症；（3）甲状腺疾病；（4）先天性肾上腺皮质增生症；（5）库欣综合征；（6）分泌雄激素的肿瘤等。对照组纳入标准：（1）月经规律；（2）基础激素水平正常，双侧窦状卵泡＞5个；（3）近6个月未使用任何甾体激素类药物；（4）同时排除：染色体异常，患有精神疾病及性传播疾病，子宫内膜病变、子宫内膜异位症、子宫畸形；卵巢囊肿等。本研究获得患者书面同意，并经医院伦理委员会批准［第201601067号］。

1.2 实验方法

1.2.1 标本采集和送检 （1）血液标本：所有患者在月经周期第3天采取静脉血2～5 mL，然后1 610×g离心15 min分离血清，立即上机检测。（2）卵泡液标本：采用低剂量促性腺激素促排卵方案，采用B超引导下经阴道取卵，选择直径为12～18 mm的卵泡穿刺取卵，留取第一管无明显血染的卵泡液，后立即以1 610×g离心10 min，取上清液分装于2个2 mL Eppendorf管中，标记后立即检测（如无法立即检测可置于-80℃冰箱保存待测）。

1.2.2 仪器和试剂 美国AB公司API3200串联质谱仪，日本岛津GC⁃MS⁃QP2010 ultra气相色谱质谱仪，雅培I2000化学发光仪，ELX800免疫酶联免疫分析仪，艾本德5804R高速冷冻离心机，美国Tal⁃boys多管漩涡混合器，博迅GZX⁃9070MBE电热干燥箱，天津奥特赛恩MTN⁃2800W氮吹浓缩装置。试剂：美国perkinelmer公司串联质谱氨基酸与酰基肉碱非衍生化试剂及配套质控品，气相色谱质谱有机酸、脂肪酸标准品和流动相甲醇均采用美国SIGMA公司，氢氧化钠和浓盐酸采用广州化学试剂厂，性激素选用罗氏配套试剂，广州康润生物抗苗勒管激素（anti⁃Mullerian hormone，AMH）定量试剂。

1.2.3 血清基础激素和卵泡液代谢物检测

1.2.3.1 基础激素检测 通过化学发光法检测血清卵泡刺激素（follicle⁃stimjlating hormone，FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、孕酮（preg⁃nendione，PROG）、雌二醇（estradiol，E2）、泌乳素（prolactin，PRL）、睾酮（testosterone，T）；用荧光酶联免疫法检测AMH激素水平。

1.2.3.2 卵泡液氨基酸检测 取卵泡液10 μL置入V型微孔板内，每孔添加100 μL工作液（甲醇：氨酸酸内标液为1∶108，用黏性封膜密封微孔板，确保密封良好，密封后，立即将微孔板置于孵育振荡器内，45℃，650～750 r/min振荡45 min，每孔转移75 μL萃取液到另一V型微孔板进入液相串联质谱分析系统检测。实验方法条件：（1）流动相由甲醇和水以80/20（v/v）的比例组成；（2）流速为1 mL/min；（3）电喷雾器温度400 ℃；（4）锥孔气流量50 L/h；（5）质谱扫描范围：100～600 m/z。

1.2.3.3 脂肪酸检测 吸取100 μL卵泡液，冰水中冷却下慢慢加入0.5 mL乙酰氯，沸水浴加热1 h，然后加入5 mL 6%Na2CO3中和，加入2 mL苯，2 000×g离心5 min，吸取苯层，重复提取1次并合并苯提取液，用氮气吹干，加入100 μL正己烷溶解样品，采用气相色谱质检分析系统检测GC⁃MS分析棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸、亚油酸脂肪酸及花生四烯酸。实验方法条件：（1）色谱柱：Rtx⁃5ms（30 m× 0.25 mm × 1.0 μm）；（2）柱温：150 ℃保留1 min，以10℃/min速率上升到230℃保留11 min，然后以10℃/min速率降至250℃保留3 min，30℃/min升至300℃保留2.5 min，30℃/min升至320℃保留3 min；（3）进样口温度：250 ℃；（4）线速度36.8 mL/min；（5）进样方式：分流（10∶1）；（6）色谱质谱接口温度：280 ℃；（7）质谱扫描范围：50～350 m/z。

1.2.3.4 有机酸检测 取1 mL卵泡液，依次盐酸羟胺肟化酮酸、乙酸乙酯萃取、N⁃O⁃双（三甲硅基）三氟乙酰胺衍生化有机酸等步骤后采用GC⁃MS进行分析［2］。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0软件对数据进行统计和分析，正态分布数据通过均值和标准差表示，区组使用独立样本t检验；非正态分布数据，均以中位数（M）和四分位数间距（Q）表示，区组差异使用秩和检验，区组阳性率比较使用卡方检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 内分泌基础激素情况 PCOS患者年龄、身体质量指数（BMI）、血清FSH、E2、PRL与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），而LH、PROG、T及AMW明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 患者血清基础激素浓度水平Tab.1 Basal hormone levels of serum in patients x±s

2.2 PCOS组与对照组体外受精结局比较 PCOS组获卵数、正常受精率、临床妊娠率显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），而胚胎着床率两组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 PCOS组和对照组体外受精结局情况Tab.2 In vitro fertilization outcome of PCOS group and control group

2.3 卵泡液氨基酸、脂肪酸、有机酸代谢色谱质谱检测 通过保留时间和特征离子进行物质定性检测，样本根据内标法结合标准品浓度进行定量，比较样本与标准品离子响应强度、峰高或峰面积计算样本浓度，代谢物色谱质谱图。PCOS组4种氨基酸：丙氨酸、瓜氨酸、甘氨酸及脯氨酸离子丰度低于对照组，而精氨酸高于对照组；PCOS组6种有机酸：乳酸、2-酮异戊酸、丙酮酸、甘油酸、戊二酸及3-羟基异丁酸离子丰度高于对照组（图1）；PCOS组6种脂肪酸：棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸浓度峰面积高于对照组。见图2。

图1 对照组和PCOS组有机酸总离子流图Fig.1 Organic acids total ion chromatography of control group and PCOS group

图2 对照组和PCOS组脂肪酸色谱图Fig.2 Fatty acids chromatography of control group and PCOS group

2.4 PCOS组与对照组卵泡液差异代谢物分析 通过检测11种氨基酸、6种脂肪酸及135种有机酸，发现PCOS组卵泡液丙氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、脯氨酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、乳酸、2-酮异戊酸、丙酮酸、甘油酸、戊二酸、3-羟基异丁酸高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），而PCOS组精氨酸低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

3 讨论

卵泡液是卵母细胞赖以生存的微环境，是卵母细胞与周围细胞进行物质交换和能量代谢的场所，其代谢物组成氨基酸、脂肪酸、有机酸等对卵母细胞的成熟发挥着重要作用［3］，并且能间接反映卵母细胞代谢水平［4］。本研究通过分析卵泡液氨基酸、脂肪酸、有机酸代谢谱，同时测定患者血清性激素和AMH浓度水平，结果显示PCOS组血清LH、T、PROG、AMH明显高于对照组，过高的T易导致高E2血症从而增加卵巢过度刺激综合征（OHSS）的发生率，AMANO等［5］报道卵泡液中过低的酪氨酸浓度也易发生OHSS，而沈亚等［6］报道成熟卵泡越多，卵子质量越好，血E2将越高。本研究PCOS组血E2及卵泡液酪氨酸与对照组无明显差异，一方面反映PCOS组卵巢并未受到过度刺激，另一方面提示两组中的E2不能单独反映卵泡质量及胚胎质量。过高LH可使卵细胞质量下降，可能导致PCOS组比对照组受精率更低，从而影响妊娠。PCOS患者卵泡发育异常与高AMH有关，过高的AMH可抑制PROG的分泌，而PCOS组血PROG水平并没有低于对照组，可能是AMH要达到一定浓度才能抑制颗粒细胞分泌PROG，这间接说明PCOS患者血雄激素和LH与AMH协同作用更强。国外有报道［7］，通过分析PCOS患者血清和卵泡液AMH关系，血清AMH是预测卵巢过度刺激综合征风险率的良好指标。

表3 患者卵泡液代谢物分析（中位数，四分位数间距）Tab.3 Analysis of the metabolites of follicular fluid in patients（M，Q） μmol/L

本研究通过比较正常对照组和PCOS组代谢谱，发现PCOS组5种氨基酸、6种有机酸及6种脂肪酸与对照组差异具有统计学意义。其中PCOS组卵泡液精氨酸明显增高，而精氨酸与获卵数及获胚数呈负相关［8］，这可能是导致妊娠结局获卵数PCOS组少于正常对照组的原因。有报道谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸浓度与囊胚形成呈正相关［9］，N-乙酰半胱氨酸可改善卵母细胞和胚胎质量［10］，本研究PCOS患者卵泡液除丙氨酸、甘氨酸外，瓜氨酸及脯氨酸也低于正常对照组，卵泡液氨基酸一种或多种的改变提示可影响卵母细胞发育潜能，可能对妊娠结局产生积极影响。脂肪酸是卵母细胞提供能源的主要物质，NIU等［11］报道PCOS患者卵泡液与血清中主要卵泡液油酸、棕榈酸、硬脂酸、十一烷酸以及亚油酸水平显著升高，与本研究PCOS组中油酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸以及花生四烯酸均高于对照组相符。有报道［12］受精并卵裂与受精未卵裂患者卵泡液脂肪酸，后者饱和脂肪酸升高、不饱和脂肪酸降低，而且胚胎碎片得分与其卵泡液中油酸含量呈正相关。过高的脂肪酸有可能影响卵泡液葡萄糖的利用及其转运［13］，从而对卵母细胞发育潜能及妊娠结局产生重要影响。有机酸是氨基酸、脂肪、糖代谢过程中所产生的羧基酸，卵泡液有机酸增高是某种酶缺乏造成代谢障碍原因之一。目前，国内外对卵泡液有机酸研究报道甚少，上海交通大学夏兰在反复IVF失败患者卵泡液分析中［14］，发现氨基己二酸、6-硝基-2-氨基己酸、氨基丙酮酸、3-羟丁酸、戊二酸、甲基-2-酮基丁酸高于1次行IVF⁃ET成功妊娠者，且代谢机制未明。本实验结果显示PCOS组乳酸、2-酮异戊酸、丙酮酸、甘油酸、戊二酸、3-羟基异丁酸高于对照组。高乳酸可能与卵母细胞在利用葡萄糖、脂肪酸等能量物质过程中发生代谢障碍造成丙酮酸增高，进而产生大量的乳酸，过多的乳酸和二羧基酸（2-酮异戊酸酸，戊二酸，3-羟基异丁酸）会给卵母细胞发育及成熟造成不利影响。

综上所述，卵泡液代谢轮廓分析能较客观、全面、准确、无创地反映胚胎的发育潜能，可作为胚胎形态学评估的补充，但卵泡液成分复杂，任何改变微环境的物质或因子都可能影响妊娠结局，除上述氨基酸、脂肪酸、有机酸可影响妊娠结局之外，同时还与患者的激素水平、肥胖和胰岛素抵抗［15］等因素有关，因此应从多方面、多因素进行综合分析评估，不断优化实验方案，提高胚胎妊娠率。