外源性胆汁酸恢复胆道外引流导致的肝再生障碍及其机制

谢经丰 范基元 袁晟光

桂林医学院附属医院肝胆胰外科（广西桂林 541001）

临床上各种原因引起的梗阻性黄疸比较常见，如肝门部胆管癌（hilar cholangiocarcinoma，HC）、肝内胆管结石等，由于肝脏储备功能较差，常常对此类患者进行肝部分切除术（partial hepatectomy，PH）前的胆道引流［1］。无论是术前胆道引流（per⁃cutaneous transhepatic cholangial drainage，PTCD）内外联合引流术还是单纯外引流术，术后血清总胆红素均下降迅速。能有效地解除梗阻性黄疸［2］。但是，研究发现外引流后会导致肝切除术后肝再生缺陷，术后肝衰风险加大，肝脏恢复能力较未引流组差［3］。外引流导致肝部分切除术后肝再生障碍的机制普遍被归于外引流打破了胆汁酸的肠肝循环继而影响术后肝再生。外引流术在临床被普遍采用而术后肝再生障碍又不可避免。但是外引流导致术后肝再生障碍机制尚不清楚［3］。HUANG等［4］证明胆道外引流同时补充0.2%外源性的CA饮食组较未补充外源性CA组能加速肝再生。但是，补充外源性胆汁酸可以恢复胆道外引流导致的肝再生障碍的具体机制尚不完全清楚。

研究发现胆汁酸与其受体法尼酯X受体（farnesoid X receptor，FXR）结合传递信号，在肝脏的损伤、修复中起重要作用。胆汁酸-FXR信号通路是正常肝再生所必需，通过胆汁酸的肠肝循环调节胆汁酸池的大小，将胆汁酸池维持在一个恒定的量［4］。肝脏表达的FXR和肠道FXR在肝损伤后的肝再生中都起作用，然而肝脏和肠道的FXR在肝再生过程所起的作用及相关作用机制是不一样的。肝脏通过诱导转录因子（Forkhead box M1b，Foxm1b）的表达，而肠粘膜通过诱导FGF15（人类是FGF19）的表达调控肝再生［5］。那么外引流后肠道FGF15的表达情况会发生怎样变化，补充外源性胆汁酸会不会恢复肠道FGF15的表达值得进一步研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 健康雄性SD大鼠90只，体重约250 g左右，由湖南斯莱克景达SPF级实验动物中心提供；胆汁酸购自Sigma公司（编号1001700885）；大鼠Ki⁃67抗体购自Abcam公司（编号ab1677767）；总RNA提取试剂盒（Tiangen公司，DP419）；Quant cDNA第一链合成试剂盒（Tiangen公司，KR103）；FGF15抗体购自LifeSpan BioSciences公司（产品编号LS⁃B15011⁃100）。

1.2 动物分组及处理 将90只雄性健康SD大鼠随机分为3组：未引流组（n=30）、外引流（ED组，n=30）、外引流同时补充外源性0.2%CA组（ED+0.2%CA组）。

未引流组：开腹分离小段胆总管，不引流，实验第7天行肝左叶、肝中叶约70%肝脏切除。

ED组：开腹分离小段胆总管，剪开小口，插入引流管，固定引流管，引流管另一端从腹腔引出行走皮下，在大鼠颈部引出固定，可以有效防止大鼠撕咬引流管，引流7 d后，行肝左叶、肝中叶约70%肝脏切除。

ED+0.2%CA组：ED模型建成后，每天给予一次3 mL 0.2%外源性CA，灌胃7 d后，行肝左叶、肝中叶约70%肝脏切除。

1.3 指标检测

1.3.1 大鼠肝组织Ki⁃67表达检测 免疫组化S⁃P法检测Ki⁃67表达。高倍视野下选取10个视野，计数1 000个肝细胞中Ki⁃67阳性细胞（细胞核染成棕黄色为阳性）所占的百分比。

1.3.2 大鼠回肠组织FGF15 mRNA表达检测 回肠组织经液氮研磨后，提取肝脏总RNA，随后进行逆转录，逆转录产物进行PCR扩增。反应条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环，最后72℃5 min延伸；GAPDH的反应条件为：94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃40 s，共25个循环，最后72℃5 min延伸。所得产物经过琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下拍照，Image J分析软件测定目的条带的灰度值，目的条带与内参条带灰度值的比值即为相对表达量。实验重复3次。实验所需引物均由上海生工生物技术公司合成。大鼠FGF15上游引物：5′⁃GTGTCGGATGA⁃AGGTCCACT⁃3，下游引物：5′⁃AGTCCACAGAGCC⁃GTCACTC⁃3′；GAPDH上游引物：5′⁃GAGGGAAAT⁃CGTGCGTGAC⁃3′，下游引物：5′⁃CTGGAAGGTGGA⁃CAGTGAG⁃3′。

1.3.3 大鼠回肠组织FGF15蛋白检测 组织细胞裂解液中加入100∶1的PMSF提取回肠蛋白，参照试剂说明书，采用BCA法进行蛋白定量，12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳分离，然后转膜、封闭，加入一抗4℃过夜，TBST缓冲液洗涤后加入二抗，室温摇床孵育1 h。暗室显影定影后扫描记录，Image J分析软件测定目的条带的灰度值。目的条带与内参条带灰度值的比值即为相对表达量。实验重复3次。

1.4 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件分析，计量资料用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肝脏 Ki⁃67阳性表达率 肝部分切除术后，ED组与ED+0.2%CA组和未引流组相比，Ki⁃67表达水平在48 h和72 h明显降低（P＜0.05），ED+0.2%CA组与未引流组相比，Ki⁃67水平在48 h明显降低（P＜0.05），其差异具有统计学意义。其他时间点（P＞0.05），差异不具有统计学意义（表1、图1）。

2.2 回肠FGF15 mRNA及蛋白水平情况 ED组FGF15 mRNA及蛋白在肝部分切除术后时各时段表达水平较弱，明显低于ED+0.2%CA组和未引流组（P＜0.05），FGF15 mRNA及蛋白表达呈现先上升后下降的总体趋势，并在24 h达到高峰，峰值较ED+0.2%CA组和未引流组明显偏低（P＜0.05）。而ED+0.2%CA组的FGF15蛋白及mRNA各时段的表达明显低于未引流组，峰值较未引流组明显偏低（P＜0.05）（表2、3，图2、3）。

表1 各组各时间点肝切除术后Ki⁃67表达情况Tab.1 Positive expression rate of Ki⁃67 at different time points in each group（n=5）±s，%

表1 各组各时间点肝切除术后Ki⁃67表达情况Tab.1 Positive expression rate of Ki⁃67 at different time points in each group（n=5）±s，%

注:*与ED+0.2%CA组同时段比较，P＜0.05；#与未引流组同时段比较，P＜0.05

组别ED组ED+0.2%CA组未引流组25.62±1.79 24.12±2.85 23.35±2.43 55.39±9.32 48.67±5.64 58.25±8.56 62.16±6.65*78.76±7.43#91.43±8.65 42.65±7.21*56.87±6.43 78.56±7.37 0 h 24 h 48 h 72 h

图1 各组肝切除术后肝脏组织Ki⁃67表达情况（免疫组化×400）Fig.1 The expression of Ki⁃67 of liver tissue after hepatectomy（Immunohistochemistry ×400）

表2 各组各时间点回肠FGF15 mRNA相对表达量（n=5）Tab.2 Relative expression levels of FGF15 mRNA at different time points in ileum tissue of each group ±s，%

注：*与ED+0.2%CA组比较，P＜0.05；#与未引流组比较，P＜0.05

组别ED组ED+0.2%CA组未引流组0 h 0.30±0.15*0.37±0.17#1.06±0.13 4 h 0.33±0.21*0.40±0.18#1.19±0.23 12 h 0.39±0.25*0.73±0.26#1.21±0.24 24 h 0.56±0.26*1.02±0.28#1.65±0.29 48 h 0.50±0.19*0.85±0.18#1.27±0.25 72 h 0.33±0.21*0.78±0.10#1.32±0.15

图2 各组大鼠肝部分切除术后各时间点回肠组织FGF15 mRNA的相对表达Fig.2 The relative quantitative expression of FGF15 mRNA in ileum after hepatectomy

图3 各组大鼠肝部分切除后各时间点回肠组织FGF15蛋白的相对表达Fig.3 The relative quantitative expression of FGF15 protein in ileum after hepatectomy

3 讨论

扩大范围手术切除是肝门部胆管癌患者获得长期生存的唯一有效手段，这些患者术前往往合并有梗阻性黄疸增加了手术风险［6］。术前胆道引流减黄可以改善患者肝功能提高手术耐受力降低手术风险而被广泛采用［7］。研究表明，胆道外引流对肝部分切除术后肝再生有明显抑制作用，术后肝衰风险加大，病死率增高［8］。胆道外引流导致肝再生障碍机制尚不完全明了，如何克服胆道外引流导致的肝部分切除术后肝再生障碍是该领域尚未解决的关键问题，因而本实验的创新之处在于模拟肝门部胆管癌手术过程，建立大鼠胆道外引流后肝部分切除动物模型，阐述胆道外引流导致肝再生障碍的可能机制，同时观测动物模型灌胃补充生理浓度外源性胆汁酸能纠正术后肝再生障碍，阐述胆汁酸信号通路在胆道外引流导致肝再生障碍及肝细胞增殖的作用重要性，为临床外引流策略法提供理论依据。

FGF15是FGFs家族的一员，高表达在小肠，主要是回肠，在肝脏不表达。胆汁酸通过激活大鼠肠道FXR促进肝再生，肠道FXR激活FGF15，FGF15通过门静脉循环到肝脏，抑制胆汁酸合成［9］。在小鼠模型中，研究人员发现肝部分切除后FGF15缺失的小鼠肝损伤和死亡的风险更高，并伴有肝脏胆汁酸的升高［10-11］。FGF15基因敲除鼠表现肝脏再生延迟［12］。外源性的加入FGF15可以恢复肠道特异性FXR缺失和机体FXR敲除小鼠的肝损伤缺陷。肠道FXR和它诱导分子FGF15在肝脏保护过程中有重要的作用［13］。

胆汁酸在肝脏的合成受肝脏、肠道FXR的负反馈调节，被胆汁酸激活的肝脏FXR诱导小分子异源二聚体伴侣（short heterodimer partner，SHP）的表达，SHP抑制CYP7A1的表达［14］。在小鼠模型中，缺乏SHP会增加CYP7A1的表达［15-16］。回肠分泌的FGF15通过门静脉到达肝脏与其受体FGFR4结合，后者通过激活下游分子的磷酸化来抑制胆汁酸合成的限速酶CYP7A1，CYP7A1的低表达可以防止残肝胆汁酸负荷过高，从而对肝再生有益［17-18］。本研究结果显示：肝切除术后，ED组FGF15蛋白和mRNA在肝部分切除术后时各时段表达水平较弱，明显低于ED+0.2%CA组和未引流组（P＜0.05），FGF15蛋白及mRNA表达呈现先上升后下降的总体趋势，并在24 h达到高峰，峰值较ED+0.2%CA组和未引流组明显偏低（P＜0.05）。ED+0.2%CA组FGF15蛋白及mRNA各时段表达明显低于未引流组，肝部分切除术后FGF15 mRNA及蛋白表达呈现先上升后下降的总体趋势，并在24 h达到高峰，峰值较未引流组明显偏低（P＜0.05）肝切除术后，ED组与ED+0.2%CA组和未引流组相比，肝组织增殖细胞核抗原（Ki⁃67）表达水平在48、72 h时间点明显降低，ED+0.2%CA组与未引流组相比，肝组织增殖细胞核抗原（Ki⁃67）水平在48 h时间点明显降低，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。其原因可能是ED组阻断了胆汁酸的肠肝循环，导致FXR表达下调，进一步影响了肠道FGF15的表达，SHP表达下调，导致CYP7A1活性增强，肝内胆汁酸池含量增加，损害肝功能，进而延迟肝再生。当以外源性0.2%CA灌胃后，恢复了部分胆汁酸的刺激，使得肠道FGF15的表达增高，SHP表达上调，一定程度上抑制CYP7A1的活性，减轻了肝脏的胆汁酸负荷，在一定程度上促进了肝再生。

本研究结果证实，外源性胆汁酸可以恢复外引流引起的肝再生障碍，这种作用可能是通过激活肠道FGF15受体实现的。