热量限制治疗海绵体神经损伤大鼠勃起功能障碍

盛明雄 万玲玲 刘昌明 李惠长 张家彬

福建医科大学附属闽东医院泌尿外科（福建福安 355000）

热量限制（caloric restriction）是指在保证生物体不发生营养不良的情况下，限制每日摄取的总热量；是延长生物寿命的最可靠方法［1］，而且有抗肿瘤［2］和神经保护［3］等多种作用。近年来热量限制治疗勃起功能障碍越来越引起关注，但其机制尚不明确。研究表明［4-5］热量限制通过上调转硫作用引起内源性硫化氢增多是其多种有益作用的主要机制。硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）是第3种被发现的具有内源性活性的气体信号分子［6］，在体内具有重要的生理调节功能，包括促进阴茎勃起［7］和神经保护［8］等。本研究通过建立大鼠海绵体神经损伤模型，分为假手术组、损伤对照组、H2S组和热量限制组，观察比较各组的血清H2S水平、勃起功能和海绵体神经修复情况，旨在证实热量限制能引起大鼠内源性H2S升高，促进损伤的海绵体血管神经修复，从而治疗海绵体神经损伤大鼠的勃起障碍。

1 材料与方法

1.1 主要材料 硫化氢钠（sodium hydrosulfide，NaHS）（上海远慕生物科技有限公司），H2S检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），甲苯胺蓝（SIG⁃MA，批号：MKBF7921）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 将112只SD大鼠（购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，体质量为200～240 g，3个月龄，性交配实验证实有正常性功能）随机分为4组，每组28只：假手术组仅游离海绵体神经3 mm并避免损伤；损伤对照组仅建立海绵体神经钳夹损伤动物模型；H2S组造模前1 h予NaHS（20 pmol/kg）腹腔注射，其他各组腹腔注射同量的生理盐水；热量限制组造模后按实验方案给予热量限制。

1.2.2 海绵体神经钳夹损伤动物模型的建立 大鼠用1%的戊巴比妥50 mg/kg经腹腔注射麻醉。备皮消毒后，取下腹部正中切口约2 cm逐层打开至盆腔，延长切口至阴茎根部，显微镜下在前列腺后外侧找到并仔细游离双侧海绵体神经（cavernous nerve，CN）3 mm，并用显微血管钳钳夹CN 2 min，血管钳扣合至最后一个咬齿，术中避免将海绵体神经完全离断导致造模失败。术中注意无菌操作，术后予青霉素3万U腹腔注射以预防大鼠感染死亡。

1.2.3 热量限制方案 除热量限制组外的大鼠给予基础饲料，自由摄食；热量限制组给予基础饲料并单笼喂养，第1周喂食量其他组平均摄食量的80%，第2周喂食量为其他组平均摄食量的70%，第3周后喂食量维持在其他组平均摄食量的60%直至处死。

1.2.4 血清硫化氢水平测定 分别于术后1、2、4、12周每组各随机取7只大鼠，经心脏采血提取血清测定大鼠血清硫化氢水平，采血后采用颈椎脱臼法处死。首先在离心管中加入0.25 mL血清、0.45 mL水和0.25 mL 1%醋酸锌后室温震荡混匀；再加入0.25 mL10%三氯乙酸，14 000 r/min离心10 min；收集上清加入133 μL 20 mmol/L对氨基二甲苯胺盐酸盐，133 μL 30 mmol/L三氯化铁，充分混匀，室温孵育20 min。用酶标仪在波长665 nm检测吸光度，根据标准曲线计算血清H2S浓度。

1.2.5 阴茎勃起功能测定 术后12周各组7只大鼠均通过电刺激CN促使海绵体充血勃起，然后进行阴茎海绵体内压（intracavernous pressure，ICP）及平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）测定。

1.2.6 海绵体神经甲苯胺蓝染色 术后1、2、4、12周取钳夹处远端3 mm的海绵体神经甲苯胺蓝染色，在显微镜下观察CN整个横切面轴突的数目。

1.2.7 免疫组化法检测大鼠阴茎组织中一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的表达 冰冻切片拿出后晾干，PBS洗3×3 min；3%H2O237℃孵育10 min，PBS冲洗3×3 min；置0.01 mol/L枸橼酸缓冲液（pH 6.0）中热修复，90℃修复15 min后自然冷却至室温，PBS冲洗3×3 min；滴加一抗4℃冰箱孵育过夜（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照），转至室温平衡30 min，PBS冲洗3×5 min；滴加二抗，37℃孵育15 min，PBS冲洗3×5 min；DAB反应染色，自来水充分冲洗；苏木素复染，脱水透明后封片。显微镜下观察，每张免切片随机选择3个不同的视野（×200）观察，进行染色强度计分与阳性细胞百分比评分，最终评分为两者加和。染色强度计分：无明显着色为0分，轻微为1分，中度为2分，重度为3分。阳性细胞百分比评分：0～5%分评为0分，6%～25%评1分，26%～50%评2分，51%～75%评3分，＞75%均评为4分。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件分析。计量资料采用ANONA单因素方差分析或t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 所有大鼠饲养顺利，成功建立海绵体神经钳夹损伤动物模型，术后恢复顺利，无死亡。

2.2 各组大鼠血清H2S含量比较 术后1、2、4、12周，血清H2S热量限制组和H2S组高于假手术组，而损伤对照组低于假手术组，热量限制组和H2S组之间差异无统计学意义；假手术组术后各个时间点较为稳定，损伤对照组逐渐减少，热量限制组和H2S组逐渐增多。见表1。

2.3 阴茎勃起功能测定 配对t检验显示，损伤对照组大鼠在电刺激海绵体神经时均无明显阴茎勃起反应，而假手术组、热量限制组和H2S组大鼠在电刺激时有明显阴茎勃起反应。ANONA分析显示电刺激前ICP/MAP比值差异无统计学意义，电刺激后各组差异有统计学意义；两两比较LSD检验显示，热量限制（P=0.000）和H2S组（P=0.000）低于假手术组，高于损伤对照组；而热量限制组和H2S组之间差异无统计学意义（P=0.051）。见表2。

表1 各组血清H2S含量比较（n=7）Tab.1 The comparison of serumal H2S between each group x± s，μmol/L

2.4 海绵体神经甲苯胺蓝染色轴突数 术后1、2、4、12周，假手术组轴突数多于其他组，热量限制组和H2S组多于损伤对照组，热量限制组和H2S组之间差异无统计学意义；假手术组术后各个时间点较为稳定，损伤对照组逐渐减少，热量限制组和H2S组逐渐增多。见表3、图1。

表2 术后12周各组ICP/MAP比值（n=7）Tab.2 The ratio of ICP/MAP 12 weeks postoperatively x±s

表3 术后各组海绵体神经轴突计数比较（n=7）Tab.3 The comparison of cavernous myelinated axons between each group postoperatively ±s，条

表3 术后各组海绵体神经轴突计数比较（n=7）Tab.3 The comparison of cavernous myelinated axons between each group postoperatively ±s，条

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与损伤对照组比较，bP＜0.05；与热量限制组比较，cP＜0.05

组别假手术组损伤对照组热量限制组H2S组F值P值1周85.6±1.27 56.4±1.13a 59.0±1.15ab 58.4±0.98ab 1 035.303 0.000 2周82.3±2.22 51.6±1.99a 62.4±1.72ab 61.4±0.98ab 369.740 0.000 4周84.0±2.45 37.4±2.07a 68.1±0.69ab 69.9±1.35ab 857.182 0.000 12周84.4±3.64 28.1±1.77a 78.4±0.98ab 78.7±1.50ab 989.864 0.000

图1 海绵体神经甲苯胺蓝染色（×200）Fig.1 The expression of cavernous myelinated axons by toluidine blue stain（× 200）

2.5 免疫组化法检测大鼠阴茎组织中NOS表达术后1、2、4、12周，假手术组NOS表达均多于其他组，热量限制组和H2S组多于损伤对照组，热量限制组和H2S组之间差异无统计学意义；假手术组术后各个时间点较为稳定，损伤对照组逐渐减少，热量限制组和H2S组逐渐增多。见表4、图2。

3 讨论

热量限制是一种有计划地减少由食物提供热量的进食方式，是指在保证生物体不发生营养不良的情况下，将其正常进食所得热量减少30%～50%。热量限制对机体有多种有益作用；目前热量限制对勃起障碍的治疗作用越来越引起关注。LA等［9］发现，低热量和低脂饮食有助提高阴茎勃起功能和体内睾酮水平，但其机制尚需不明确。本研究首次发现热量限制引起内源性H2S增多是其主要机制之一。

表4 各组大鼠阴茎组织NOS表达比较（n=7）Tab.4 The comparison the expression of NOS in cavernous body between each group ±s，分

表4 各组大鼠阴茎组织NOS表达比较（n=7）Tab.4 The comparison the expression of NOS in cavernous body between each group ±s，分

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与损伤对照组比较，bP＜0.05；与热量限制组比较，cP＜0.05

组别假手术组损伤对照组热量限制组H2S组F值P值1周7.14±0.69 4.71±0.76a 5.85±0.69ab 6.00±0.58ab 14.872 0.000 2周7.28±0.49 3.57±0.53a 6.00±0.57ab 6.28±0.49ab 63.478 0.000 4周7.42±0.53 2.71±0.76a 6.29±0.49ab 6.43±0.48ab 58.233 0.000 12周7.57±0.53 2.29±0.95a 6.57±0.53ab 6.71±0.76ab 77.116 0.000

图2 免疫组化法检测大鼠阴茎组织中NOS表达（×400）Fig.2 The expression of NOS in cavernous body by immunohistochemical method（× 400）

研究表明［4］热量限制可通过上调转硫作用引起内源性H2S增多。在哺乳动物体内，H2S由含硫氨基酸在—胱硫醚-β-合酶和胱硫醚-γ-裂合酶转硫作用下产生；是一种内源性气体信号分子，具有神经保护等多种作用。SARUKHANI等［10］发现H2S能抗6-羟基多巴诱导的神经毒性，具有明显的抗帕金森和神经保护作用。H2S还可作用于ATP敏感性钾离子通道舒张血管平滑肌，与睾酮及NO协同作用舒张阴茎海绵体平滑肌，从而促进阴茎勃起［7］。本研究显示：热量限制可以引起内源性H2S水平增多，给予外源性H2S也有相似作用；热量限制组和H2S组的海绵体神经轴突数多于损伤对照组且逐渐增多，而损伤对照组逐渐减少。本研究率先证实热量限制既可引起H2S水平增多又可促进损伤的海绵体神经修复，这表明热量限制可通过促进内源性H2S水平增多，从而促进海绵体神经损伤修复；这可能是其对治疗海绵体神经损伤大鼠勃起功能障碍的主要机制之一。研究表明［4-5，11］热量限制引起内源性硫化氢增多是其多种有益作用的主要机制；本研究结果与其相符。

阴茎海绵体组织中NOS主要由神经型NOS产生［12］，是催化L-精氨酸分解产生在阴茎勃起过程中起决定作用的递质NO的关键酶，其活性高低可反映阴茎的勃起功能，勃起功能障碍与阴茎组织NOS活性的下降有关［13］。目前关于海绵体神经再生的研究也常常通过检测阴茎背神经中NOS阳性神经纤维表达来间接反映海绵体神经纤维的再生情况［14］。本研究发现损伤对照组NOS表达较假手术组明显降低，而热量限制和外源性H2S均可促进阴茎海绵体NOS表达。这表明，热量限制和外源性H2S均可促进递质NOS产生，并促进海绵体神经再生，从而改善勃起功能。

前列腺氩氦刀冷冻消融术由于疗效确切，创伤小；成为前列腺癌的可选择治疗方法之一［15-16］。勃起功能障碍是其术后最常见的并发症，术中冷冻冰球损伤支配阴茎勃起的血管神经束是术后发生勃起功能障碍的主要原因［17］。目前多采用术后早期口服5型磷酸二酯酶抑制剂治疗，但因无法修复损伤的血管神经束，疗效欠佳。本研究发现热量限制可促进海绵体神经再生，从而改善勃起功能；这为前列腺癌氩氦刀冷冻消融术后勃起功能障碍提供新思路。

本研究存在不足之处，虽然本研究证实热量限制可促进海绵体神经损伤大鼠勃起障碍康复，但是由于本研究观察时限最长只到12周，其长期疗效尚需进一步研究。

综上所述，热量限制通过引起内源性H2S水平升高促进大鼠海绵体损伤神经修复和阴茎海绵体NOS表达，从而促进海绵体神经损伤大鼠勃起障碍康复。