沉默FBI⁃1基因对乳腺癌MCF⁃7细胞周期和凋亡的影响

陈茂剑 王丽 杨伟萍 覃庆洪 谭启杏 练斌 韦长元

1广西医科大学附属肿瘤医院乳腺外科（南宁 530021）；2柳州市人民医院乳腺外科（广西柳州 545006）

人类免疫缺陷病毒短转录诱导物连接因子1（factor that binds to the inducer of short transcripts of human immunodeficiency virus⁃1，FBI⁃1）是一种具有原癌基因活性的转录抑制因子，它可调控多种肿瘤相关基因的转录，是肿瘤发生、发展过程中的上游关键基因［1-2］。本课题组前期研究也发现FBI⁃1参与乳腺癌MCF⁃7细胞的增殖：在MCF⁃7细胞中，FBI⁃1较正常乳腺上皮MCF⁃10A细胞表达增高，而沉默FBI⁃1能显著抑制MCF⁃7细胞增殖［3］。本研究进一步探讨FBI⁃1沉默对MCF⁃7细胞周期和凋亡的影响及其可能机制，为寻找治疗乳腺癌的策略提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人乳腺癌MCF⁃7细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

1.1.2 药品及试剂 胎牛血清（FBS）和DMEM培养基（Bioind公司）；细胞周期试剂盒（联科生物）；细胞凋亡试剂盒（BD公司）；逆转录和qRT⁃PCR试剂盒（Takara公司）。引物合成由广州艾基生物技术有限公司完成；FBI⁃1抗体（Abcam公司）；p53、p21和GAPDH抗体（CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人乳腺癌MCF⁃7细胞用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中进行培养。

1.2.2 慢病毒构建 FBI⁃1沉默重组慢病毒颗粒及阴性对照慢病毒颗粒由苏州吉玛基因股份有限公司构建，Polybrene由苏州吉玛基因股份有限公司提供。从所构建的3条序列中选择1条沉默效率最高的序列进入本实验，其shRNA⁃FBI⁃1序列为GCAGCTGGACCTTGTAGATCA，shRNA⁃NC序列为TTCTCCGAACGTGTCACGT。

1.2.3 细胞转染 细胞转染步骤参考本课题组前期发表的文献［3］，转染成功后收集各组细胞进行后续实验。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期 分别收集各组细胞，用胰蛋白酶消化后制备单细胞悬液，具体操作严格按试剂盒说明书进行，300目尼龙网过滤后采用流式细胞仪检测细胞周期情况。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 分别收集各组细胞，用胰蛋白酶消化后制备单细胞悬液，具体操作严格按试剂盒说明书进行，300目尼龙网过滤后采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 qRT⁃PCR检测mRNA表达 采用qRT⁃PCR法，FBI⁃1和GAPDH引物参考文献［3］，p53和p21引物参考文献［4］。反应条件为95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，30 s；72℃，30 s；第2步至第4步进行40个循环。以GAPDH作为内参，用2⁃△△CT法计算目的基因的相对表达量。

1.2.7 Western blot检测蛋白表达 取各组细胞，严格按试剂盒说明进行操作，FBI⁃1一抗1∶10 000稀释，p53、p21和GAPDH一抗1∶1 000稀释，ECL系统显影。使用Image J软件进行灰度分析，GAPDH蛋白条带为内参照。

1.2.8 统计学方法 使用SPSS 17.0统计分析软件对相关数据进行统计学处理，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，实验进行3次重复，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 shRNA⁃FBI⁃1慢病毒感染MCF⁃7细胞对FBI⁃1表达的影响 qRT⁃PCR和Western blot检测结果显示，与 shRNA⁃NC 组比较，shRNA⁃FBI⁃1 组 FBI⁃1 mRNA（图1A，1.00±0.00vs.0.33±0.01，P＜0.01）及蛋白（图1B，1.05±0.05vs.0.59±0.02，P＜0.01）表达显著降低，差异有统计学意义。

图1 shRNA⁃FBI⁃1慢病毒感染MCF⁃7细胞对FBI⁃1 mRNA（A）及蛋白（B）表达的影响Fig.1 The expressions of FBI⁃1 mRNA（A）and protein（B）in MCF⁃7 cells infected with shRNA⁃FBI⁃1

2.2 沉默FBI⁃1对MCF⁃7细胞周期的影响 流式细胞术结果显示，与shRNA⁃NC组比较，shRNA⁃FBI⁃1组G0/G1期细胞数明显增加［（60.21± 0.80）%vs.（72.99±0.40）%，P＜0.01］，S期和G2/M期细胞数显著减少［（27.28±0.21）%vs.（21.64±0.67）%，P＜ 0.05；（12.51±0.70）%vs.（5.37 ± 0.27）%，P＜0.01］，可见细胞被阻滞于G0/G1期。见图2。

2.3 沉默FBI⁃1对MCF⁃7细胞凋亡的影响 流式细胞术结果显示，与shRNA⁃NC组比较，shRNA⁃FBI⁃1组细胞凋亡率显著增加［（2.84± 0.22）%vs.（5.14±0.48）%，P＜0.01］，差异有统计学意义。见图3。

2.4 沉默FBI⁃1对MCF⁃7细胞p53和p21 mRNA表达的影响 qRT⁃PCR结果显示，与shRNA⁃NC组比较，shRNA⁃FBI⁃1组p53和p21 mRNA的表达明显上调（1.00±0.00vs.1.72±0.21，P＜0.01；1.00±0.00vs.1.51±0.13，P＜0.01），差异有统计学意义。见图4。

2.5 沉默FBI⁃1对MCF⁃7细胞p53和p21蛋白表达的影响 Western blot结果显示，与shRNA⁃NC组比较，shRNA⁃FBI⁃1组p53和p21蛋白的表达显著增加（0.60±0.04vs.1.12±0.09，P＜0.01；0.71±0.06vs.1.01±0.02，P＜0.01），差异有统计学意义。见图5。

图2 沉默FBI⁃1对MCF⁃7细胞周期的影响Fig.2 The effect of silencing FBI⁃1 on cell cycle of MCF⁃7 cells

图3 沉默FBI⁃1对MCF⁃7细胞凋亡的影响Fig.3 The effect of silencing FBI⁃1 on apoptosis of MCF⁃7 cells

图4 沉默FBI⁃1对MCF⁃7细胞p53和p21 mRNA表达的影响Fig.4 The effect of silencing FBI⁃1 on the mRNA levels of p53 and p21 in MCF⁃7 cells

3 讨论

图5 沉默FBI⁃1对MCF⁃7细胞p53和p21蛋白表达的影响Fig.5 The effect of silencing FBI⁃1 on the protein levels of p53 and p21 in MCF⁃7 cells

乳腺癌发生、发展、侵袭及转移是一个多阶段的、多基因参与的复杂过程，目前其机制尚未完全阐明。随着免疫学和基因技术的发展进步，肿瘤在基因治疗方面取得了巨大进步，如何选择治疗性基因是肿瘤基因治疗中最关键的问题。研究［5-7］发现FBI⁃1不仅在细胞分化和机体发育等多种重要生命活动中扮演着重要角色，而且与肝癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌和鼻咽癌等多种恶性肿瘤的发生、发展及转归密切相关。FBI⁃1基因敲除小鼠胚胎均在胚胎期致死［8］。敲除FBI⁃1的鼠胚胎成纤维细胞（embryo fibroblasts，MEFs）失去了转化和癌变的能力，而过表达FBI⁃1的MEFs则转化能力增强，癌变速度加快［8］。LIN等［9］通过体内外实验研究发现，沉默FBI⁃1明显抑制肝癌细胞的增殖。YUAN等［10］研究发现，给grp 170⁃FBI⁃1复合体处理的肺癌小鼠，其肿瘤的生长受到明显的抑制，并且小鼠的存活时间明显延长。然而FBI⁃1对乳腺癌细胞的影响及机制目前尚不明确。笔者前期研究已发现沉默FBI⁃1后，乳腺癌MCF⁃7细胞增殖能力明显下降［3］。本研究继续探讨FBI⁃1与MCF⁃7细胞周期和细胞凋亡变化的关联性。结果显示，沉默FBI⁃1表达后，MCF⁃7细胞周期被阻滞于G0/G1期，并且S期和G2/M期的细胞数明显减少，细胞凋亡率显著增高，提示沉默FBI⁃1抑制乳腺癌增殖很可能与其阻滞细胞于G0/G1期以及诱导细胞凋亡有关，FBI⁃1可能成为治疗乳腺癌的潜在靶点。

p53是目前研究最广泛的抑癌基因，作为一个重要的调控因子，p53在诱导细胞周期阻滞、凋亡、DNA修复或细胞衰老等过程中发挥重要作用［11］。大量研究［12-13］表明，p53的抗肿瘤作用与其阻滞细胞周期和诱导细胞发生凋亡密切相关。季玉连等［14］在研究FBI⁃1抑制胃癌细胞凋亡的研究中发现，FBI⁃1可抑制p53的表达。FENG 等［12］研究发现，FBI⁃1过表达使肝癌细胞G2/M期细胞数明显增多，p53和其下游因子p21表达下调，而沉默FBI⁃1可减少G2/M期细胞数，上调p53和p21表达。细胞依赖性激酶抑制剂家族的重要成员p21是p53信号通路下游因子，在DNA复制和损伤修复、细胞分化、衰老、周期调控、凋亡及肿瘤形成和发展等过程也发挥重要作用，p21可以通过细胞周期调控作用间接参与细胞凋亡进而抑制肿瘤细胞的生长［15-16］。本研究结果显示，沉默FBI⁃1基因的表达后，MCF⁃7细胞p53和p21表达显著增加，表明沉默FBI⁃1可能通过调控p53⁃p21途径进而阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡。

本研究结果表明，沉默FBI⁃1可阻滞乳腺癌MCF⁃7细胞周期进程和促进细胞凋亡，从而起到抑癌作用，其机制可能与上调p53和p21表达有关。但本研究仅是FBI⁃1体外实验的初探，并且机制研究深度不够，FBI⁃1能否作为乳腺癌防治新靶点尚需后续相关动物体内实验及具体分子机制研究来进一步证实，以期为以FBI⁃1为靶点的新药开发及乳腺癌临床防治提供更多的理论与实验依据。