斯达油脂酵母ZW-25利用粗甘油发酵产油脂的研究

李杰，肖泽涛，郭书贤

（南阳理工学院生化学院，河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南南阳473004）

微生物油脂（microbial lipids）又称单细胞油脂（single cell lipid，SCO），是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源、氮源，辅以无机盐生产的油脂和一些有商业价值的脂质。微生物油脂在能源环保、食品生产、日用化工等方面有广泛的应用。在当前人口不断增长的情况下，对于油脂的需求量巨大，而自然资源却日益贫乏，因此，开发新的油脂资源具有重要的现实意义[1-7]。

生物柴油由于燃烧性好并且产生的污染少而受到许多国家的青睐，近年来，生物柴油行业急剧扩张。粗甘油是生产生物柴油的副产物，生物柴油行业规模的扩张使得副产物粗甘油大量产生。据统计，粗甘油副产物约占总产物量的10%，如何将粗甘油回收利用，成为了一个新的严峻挑战[8-13]。

粗甘油可作为碳源被产油微生物通过发酵转化为微生物油脂，相关的研究已经取得了一定进展。2013年，Shen等研究了T.fermentans利用纯甘油进行发酵产油脂的情况，发现其最大的生物量、油脂产量和油脂含量分别为4.0 g/L、1.4 g/L和35.0%[14]。2015年，Spier等对L.starkeyi利用粗甘油发酵产油脂的情况进行了研究，试验表明，发酵120 h后，L.starkeyi的生物量、油脂产量和油脂含量分别为5.74、2.89 g/L和50.49%[15]。2016年，胡洋等利用粗甘油发酵产微生物油脂的研究中，选取蛋白胨+酵母浸膏作为混合氮源，以粗甘油为碳源，通过改变氮源的含量控制培养基的C/N，结果表明，C/N 为 60时，T.fermentans、T.cutaneum和L.starkeyi的生物量达到最大值，分别为14.24、15.07 g/L和17.74 g/L；在C/N为110时，油脂含量达到最大值，分别为32.37%、28.55%和32.27%[16]。由此说明，菌株的生长和油脂积累对于C/N的需求是不同的。因此，本研究主要针对产油脂微生物，考察以粗甘油作为发酵培养基中的碳源，不同碳氮比对其产油脂的影响，以期为微生物利用粗甘油发酵产油脂提供理论和实践依据。

1 材料

1.1 原料

大豆油：南阳万德隆超市。

1.2 菌株

斯达油脂酵母1809：中国工业微生物菌种保藏管理中心；斯达油脂酵母 ZW-25、MM-17、YP-07：河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室保藏。

1.3 培养基

酵母基础培养基（yeast extract peptone dextrose，YEPD）液体培养基（g/L）：葡萄糖 20，酵母膏 10，蛋白胨10，pH自然。

YEPD固体培养基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏10，蛋白胨10，琼脂粉20，pH自然。

基础发酵培养基（g/L）[17]：葡萄糖 70，（NH4）2SO42.0，酵母粉 0.5，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，pH 5.8～6.0。

粗甘油发酵培养基：根据待考察的粗甘油添加量，用粗甘油替代基础发酵培养基中的葡萄糖，其余成分同基础发酵培养基。

1.4 试剂

NH4Cl、KH2PO4、K2HPO4、MgCl2、CaCl2、FeSO4·7H2O、ZnSO4、Na2SO4、MnSO4·4H2O、KOH、NaCl、H3PO4、葡萄糖、香草醛、甲醇：均为国产分析纯。

酵母膏、酵母粉、蛋白胨、琼脂粉：均为生物试剂。

1.5 主要仪器设备

LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；BSP-150电热恒温培养箱：上海博迅实业有限公司；HZQ-B数显恒温摇床：苏州威尔实验用品有限公司；SW-CJ超净工作台：苏州净化设备有限公司；PHS-3C精密pH计：上海雷磁仪器有限公司；CX31生物显微镜：日本奥林巴斯株式会社；7890A气相色谱仪：上海天美分析仪器有限公司。

2 方法

2.1 粗甘油制备

粗甘油的制备参考孔秀梅[18]，按醇油摩尔比4∶1进行酯交换反应，按油重0.32%加入催化剂氢氧化钾，控制温度80℃，搅拌反应4 h。反应完成后回收残余甲醇，然后冷却静置。分层后收集下层液体，用50%的H2SO4调节pH值至3.0，除去皂化物，即得试验用粗甘油。

2.2 培养方法

将保存于试管斜面的菌株活化，挑取一环接种于YEPD液体培养基，25℃，145 r/min培养48 h，作种子液。将种子液以10%接种量分别接种于基础发酵培养基和粗甘油发酵培养基，25℃、145 r/min培养5 d。

2.3 高产油脂菌株的筛选

设置甘油培养基（试验组）和葡萄糖培养基（对照组），采用平板培养和摇瓶发酵的方法对斯达油脂酵母1809、ZW-25、MM-17和YP-07进行培养，筛选出利用粗甘油发酵产油脂的高产菌株进行后续试验。

2.4 碳源、氮源对斯达油脂酵母ZW-25发酵产油脂的影响

2.4.1 粗甘油浓度的影响

在发酵培养基中分别添加不同浓度的粗甘油，考察其对斯达油脂酵母ZW-25发酵产油脂的影响，粗甘油浓度范围25 g/L～115 g/L，浓度梯度为15 g/L。

2.4.2 氮源种类和浓度的影响

固定发酵培养基中粗甘油浓度70 g/L，分别考察不同种类氮源对斯达油脂酵母ZW-25发酵产油脂的影响；考察有机氮源时固定无机氮源浓度，考察无机氮源时固定有机氮源浓度；有机氮源选择酵母粉、蛋白胨、尿素，无机氮源选择 NH4Cl、（NH4）2SO4、NaNO3、NH4NO3。

2.4.3 碳氮比的影响

固定发酵培养基中的氮源种类和浓度，改变粗甘油的添加量，选择粗甘油浓度范围25 g/L～115 g/L，浓度梯度15 g/L，分别考察不同碳氮比对斯达油脂酵母ZW-25发酵产油脂的影响。

2.5 斯达油脂酵母ZW-25利用粗甘油发酵产油脂的过程研究

将斯达油脂酵母ZW-25种子液以10%接种量接种于粗甘油发酵培养基，25℃、145 r/min培养144 h，每隔12小时取样，测定菌体生物量、油脂产量、油脂含量、油脂系数、pH值和残余甘油浓度，考察菌株在发酵过程中各指标的变化规律。

2.6 试验指标的测定和计算方法

2.6.1 生物量测定

发酵液进行离心，将湿菌体105℃烘干至恒重，称重。菌体生物量以g/L表示（g为干菌体质量，L为所用发酵液体积）[19]。

2.6.2 油脂产量测定（磷酸香草醛显色法）

分别配制浓度为 0、0.08、0.1、0.12、0.2、0.16 g/L 油脂样品（溶剂为无水乙醇-正己烷，体积比配比为1∶2）。分别取油脂样品各1 mL水浴蒸干后加入2 mL98%硫酸，混匀后置于90℃水浴中加热20 min，取出在冰水浴中冷却后，加入0.25 g/L香草醛磷酸溶液（0.025 g香草醛用1 mL无水乙醇溶解，再用34%磷酸定容到100 mL）3 mL，摇匀后室温反应20 min，在526 nm处测吸光度，绘制标准曲线。菌体用无菌水洗涤两次后适当稀释，取1mL菌悬液，按标准曲线的制作方法测定油脂浓度，乘以稀释倍数即得油脂产量[20]。

2.6.3 油脂含量测定

油脂含量/%=油脂产量/生物量×100

2.6.4 油脂系数测定

油脂系数=油脂产量/粗甘油消耗量×100

2.6.5 pH值测定

pH计预热30 min，将电极浸入缓冲溶液进行校正，即可使用[21]。

2.6.6 残余甘油浓度的测定

取5 mL丙三醇稀释至50 mL，从中吸取0、0.8、1.6、2.4、3.2、4 mL 溶液分别加入 6 只比色管（10 mL）中，用含18%乙醇的饱和NaCl溶液定容，摇匀静置；再分别从各比色管中吸取1.14 mL溶液加入6只装有10 mL 5%NaOH和0.86 mL 15%CuSO4的小烧杯中，混匀后静置10 min显色，取适量溶液于8 000 r/min下离心5 min。然后取上清液，于630 nm波长下测定吸光度，并绘制标准曲线。将待测发酵液用含18%乙醇的饱和NaCl溶液适当稀释，测其粗甘油浓度[22]。

2.7 斯达油脂酵母ZW-25利用粗甘油发酵产油脂的脂肪酸组成分析

采用酸热法[23]提取油脂，油脂经甲酯化后，利用气相色谱对其脂肪酸组成和含量进行分析。

样品甲酯化方法参考曲威[24]，取待测的微生物油脂0.1 g，加入0.5 mol/L KOH-甲醇溶液2 mL，于65℃水浴中皂化 30 min，加入 BF3-乙醚溶液（1 ∶1）0.2 mL，在65℃水浴中甲酯化5 min，取出，迅速冷水冷却，加入石油醚2 mL，振荡，静置20 min。吸取上清液0.3μL～0.5 μL作为气相色谱的进样样品。

气相色谱检测条件：FFAP色谱柱，进样口270℃，检测器270℃；柱温：初始温度60℃，以8℃/min升温至185℃，保持2 min；以2℃/min升温至260℃保持3 min；载气：N2；柱流速：1 mL/min；分流比 20 ∶1；进样量1 μL。使用CHEM32软件进行数据处理。将测得的样品色谱图各峰的保留时间与脂肪酸标准品的保留时间作比较，确定样品色谱图各峰的性质，各组分含量（P）与不饱和脂肪酸指数（IUFA）计算如下式。

IUFA=1×单烯酸含量/%+2×二烯酸含量/%+…+n×n稀酸含量/%

式中：IUFA为不饱和脂肪酸指数，%。

式中：P表示组分的相对含量，%；Ai表示组分的峰面积；∑Ai表示各组分的峰面积总和。

3 结果与分析

3.1 标准曲线绘制结果

甘油和磷酸香草醛显色法标准曲线见图1、图2。

图1 甘油标准曲线Fig.1 The standard curve of glycerin

图2 磷酸香草醛显色法标准曲线Fig.2 Standard curve of sulfo-phospho-vanillin reaction

由图1可知，甘油标准曲线为y=19.386x+0.001 3，曲线的相关系数为R2=0.996 5。由图2可知，斯达油脂酵母油脂标准曲线y=3.757 7x-0.088 2，相关系数为R2=0.993 1。

3.2 不同斯达油脂酵母菌株在粗甘油平板和葡萄糖平板上的生长情况

将待筛选的斯达油脂酵母菌株ZW-25、MM-17、1809、YP-07分别接种在含粗甘油培养基和葡萄糖培养基的平板上，25℃、培养5 d，每天观察并记录两组平板的生长情况，结果见表1。

表1 各菌株在粗甘油平板和葡萄糖平板上的生长情况Table 1 The growth situation of different strain on crude glycerol and glucose plate

由表1可知，4株斯达油脂酵母菌株均可在以粗甘油为碳源的培养基上生长，菌株ZW-25在以粗甘油为碳源的培养基平板上长势良好，说明其更适合在以粗甘油为碳源的培养基上生长。

3.3 不同斯达油脂酵母菌株以粗甘油为碳源发酵产油脂的研究

根据2.3的方法进行试验，各菌株利用粗甘油发酵产油脂情况如图3所示。

图3 各菌株利用粗甘油发酵产油脂情况Fig.3 The fermentation of producing lipid situation of using crude glycerol of different strain

由图3可知，对照组中，斯达油脂酵母各菌株的生物量和油脂产量均高于试验组，说明各菌株对葡萄糖的利用程度高于粗甘油。试验组中，菌株ZW-25的生物量、油脂产量、油脂含量和油脂系数与其它菌株相比均是最高的，分别为11.99 g/L、5.45 g/L、45.65%和17.27，但在对照组中，ZW-25的生物量和油脂产量低于1809和MM-17，说明菌株1809和MM-17对粗甘油的耐受程度低于ZW-25。故选择斯达油脂酵母ZW-25作为后续试验的菌株。

3.4 不同粗甘油浓度对斯达油脂酵母ZW-25发酵产油脂的影响

根据2.4中的方法考察粗甘油浓度对斯达油脂酵母ZW-25发酵产油脂的影响，结果如图4所示。

图4 斯达油脂酵母ZW-25利用不同浓度粗甘油发酵产油脂情况Fig.4 The fermentation of producing lipid situation of using different crude glycerol concentration by Lipomyces starkeyi ZW-25

由图4可知，斯达油脂酵母ZW-25的生物量和油脂产量随粗甘油浓度增加而逐渐增大，当粗甘油浓度为55 g/L时，其生物量达最大值，为14.17 g/L；而油脂产量在粗甘油浓度为40 g/L时达最大值6.97 g/L，且其生物量高达13.79 g/L；当粗甘油浓度为70 g/L时，菌体生物量和油脂产量开始降低，可能是由于粗甘油的浓度过高而影响细胞的渗透压。此外，粗甘油浓度为40 g/L时，菌株的油脂含量和油脂系数最高，分别为50.52%和18.12。故斯达油脂酵母ZW-25发酵产油脂适宜的粗甘油浓度为40 g/L。

3.5 氮源种类和浓度对斯达油脂酵母ZW-25发酵产油脂的影响

根据2.4中的方法考察氮源种类和浓度对斯达油脂酵母ZW-25发酵产油脂的影响，结果如图5所示。

图5 斯达油脂酵母ZW-25利用不同氮源发酵产油脂情况Fig.5 The fermentation of producing lipid situation of using different nitrogen source by Lipomyces starkeyi ZW-25

由图5可知，有机氮源为酵母粉时，斯达油脂酵母ZW-25发酵产油脂的各项指标均最高，其中生物量为13.77g/L，油脂产量为8.22g/L，油脂含量为59.74%，油脂系数为15.02；相比之下，在以蛋白胨为有机氮源时，其各项指标略低；以尿素为有机氮源时，各项指标偏低。

对无机氮源而言，以（NH4）2SO4作为无机氮源时，斯达油脂酵母ZW-25发酵产油脂的各项指标均最高，其中生物量为12.04 g/L，油脂产量为6.13 g/L，油脂含量为50.99%，油脂系数为15.01；以NH4Cl、NaNO3、NH4NO3作为无机氮源时，其各项指标偏低，以NaNO3为无机氮源时，其发酵产油脂各项指标最低。

故斯达油脂酵母ZW-25发酵产油脂的适宜氮源为：酵母粉+（NH4）2SO4。

3.6 不同碳氮比对斯达油脂酵母ZW-25发酵产油脂的影响

根据2.4中的方法考察不同碳氮比对斯达油脂酵母ZW-25发酵产油脂的影响，结果如图6所示。

由图6可知，斯达油脂酵母ZW-25在低碳氮比（25～40）条件下培养时，菌体生长速度较快，生物量从8.91 g/L 上升至 13.79 g/L；菌株在高碳氮比（40～55）条件下培养时，生长速度较慢，生物量从13.79 g/L上升至14.17 g/L，但油脂产量较高；碳氮比为40时，油脂产量达6.97 g/L，说明高碳氮比利于菌株产油。当碳氮比大于55时，菌株的生物量和油脂产量逐渐减少，可能是由于粗甘油浓度过高影响细胞的渗透压，不利于菌株生长及产油。故斯达油脂酵母ZW-25发酵产油的适宜碳氮比为40，经转换可得：粗甘油浓度为40 g/L、酵母粉 0.5 g/L、（NH4）2SO42.0 g/L。

图6 斯达油脂酵母ZW-25在不同碳氮比条件下发酵产油脂情况Fig.6 The fermentation of producing lipid situation under different carbon-nitrogen ratio by Lipomyces starkeyi ZW-25

3.7 斯达油脂酵母ZW-25利用粗甘油发酵产油脂的过程研究

根据2.5的方法对斯达油脂酵母ZW-25利用粗甘油发酵产油脂的过程进行研究，结果如图7所示。

图7 斯达油脂酵母ZW-25利用粗甘油发酵产油脂各指标的变化情况Fig.7 The change of different index of using crude glycerol fermentation for producing lipid by Lipomyces starkeyi ZW-25

由图7可知，斯达油脂酵母ZW-25的生物量和油脂产量随发酵时间的延长呈逐渐上升趋势，144h达最大值，分别为10.03 g/L、6.07 g/L；粗甘油浓度随发酵时间的延长逐渐降低，起始浓度从40 g/L逐渐下降至7.15 g/L；油脂含量在0～12 h上升较快，12 h达41.18%，随后缓慢上升，到144 h达60.6%；油脂系数在0～60 h上升较快，60 h达14.12，随后趋于平缓；随发酵时间的延长，发酵液pH值下降趋势明显，0～12 h，pH值从起始的5.94下降至3.96，随后发酵液pH值缓慢下降，到144 h下降至2.41，但在发酵期间，菌体的生长未出现减缓的趋势，说明菌株对发酵液pH值的变化具有较强的耐受性。

3.8 斯达油脂酵母ZW-25利用粗甘油发酵产油脂的脂肪酸组成分析

根据2.7的方法对斯达油脂酵母ZW-25利用粗甘油发酵产油脂的脂肪酸组成进行分析，结果如图8和表2所示。

由图8和表2可知，斯达油脂酵母ZW-25利用粗甘油发酵所产油脂中含多种脂肪酸，其中含量最高的为油酸，其次是棕榈酸，两种脂肪酸占总脂肪酸的89.5%，由此可见其利用粗甘油发酵所产油脂的脂肪酸主要是以C16和C18系脂肪酸为主，可作为新的油源使用。

图8 斯达油脂酵母ZW-25利用粗甘油发酵产油脂的气相色谱图Fig.8 The gas chromatogram of using crude glycerol fermentation for producing lipid by Lipomyces starkeyi ZW-25

表2 斯达油脂酵母ZW-25利用粗甘油发酵产油脂的脂肪酸组成分析Table 2 The fatty acid composition analysis of using crude glycerol fermentation for producing lipid by Lipomyces starkeyi ZW-25

4 结论

1）通过平板培养和摇瓶发酵的方法从斯达油脂酵母1809、ZW-25、MM-17和YP-07中筛选出利用粗甘油发酵产油脂的高产菌株ZW-25。

2）碳源和氮源对斯达油脂酵母ZW-25利用粗甘油发酵产油脂有较大影响，培养基中适宜的C/N为40，适宜的碳源氮源组成为：粗甘油浓度40 g/L，酵母粉 0.5 g/L，（NH4）2SO42.0 g/L。此条件下，其生物量、油脂产量、油脂含量和油脂系数分别可达13.79、6.97 g/L、50.52%和18.12。

3）斯达油脂酵母ZW-25的生物量、油脂产量、油脂含量、油脂系数随发酵时间的延长呈逐渐上升趋势，144 h达最大值；粗甘油浓度随发酵时间的延长逐渐降低；随发酵时间的延长，发酵液pH值下降趋势明显，但菌体生长未出现减缓趋势，说明菌株对发酵液pH值的变化具有较强的耐受性。

4）斯达油脂酵母ZW-25利用粗甘油发酵所产油脂的脂肪酸主要是以C16和C18系脂肪酸为主，其中油酸和棕榈酸含量较高，分别为58.58%和30.92%，可作为功能性油脂的油源。

综上所述，斯达油脂酵母ZW-25具有利用粗甘油发酵产油脂的应用潜力，研究结果可为粗甘油的综合利用开辟新的途径。