干扰素γ对星形胶质细胞中JAK-STAT细胞信号通路的激活作用

韩 浩 宣丽颖 白冬松 宋葆华 宝鲁尔

(内蒙古民族大学医学院，内蒙古 通辽 028005)

多发性硬化(MS)是以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫病，发病群体以中青年居多，但老年病例也较为常见。星形胶质细胞是MS病理变化中重要的靶细胞，常受累及的细胞分布于脑室周围白质、脊髓、脑干和小脑等〔1〕。该病以病灶多发性和病程的时间多发性为主要特点。目前，MS治疗手段较为局限，相关研究显示干扰素(IFN)γ对于控制青年及老年MS的进展有着重要作用〔2〕。其中，IFNγ对星形胶质细胞JAK-STAT细胞信号通路的调节作用机制值得深入研究。本研究拟通过检测干扰素调节因子(IRF)1及NLRC5来探讨IFNγ促进星形胶质细胞中JAK-STAT细胞信号通路的激活作用。

1 材料与方法

1.1星形胶质细胞株培养及IFNγ的作用 人星形胶质细胞株购置于齐氏生物科技公司，细胞培养采用人神经星形胶质细胞培养试剂盒(Human Brain Prima CellTM：Normal Nerve Astrocytes Cells Cat No.3-0505)进行，所有操作按照试剂盒说明书进行。星形胶质细胞培养于37℃5%CO2培养箱。获得足够的细胞后用EDTA消化细胞，并将细胞浓度调整在3× 104/cm2。实验组加入IFNγ至终浓度为250 IU/ml，空白对照组加入磷酸盐缓冲液(PBS)。

1.2Western印迹 离心获得实验组及空白对照组的检测星形胶质细胞，进行检测。细胞样品先加入细胞裂解液RIPA裂解。然后将两组获得的蛋白样品进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，进而将电泳结果转膜到聚偏氟二乙烯(PVDF)膜。转膜后加入封闭液在室温下封闭60 min。4℃下，分别加入多克隆山羊抗人的IRF1及NLRC5的IgG一抗(RD公司，1∶200稀释)孵育60 min。二抗加入稀释好的辣根过氧化物酶标记的小鼠抗山羊的IgG孵育60 min，加入洗涤液5～10 min洗涤3次。内参照物采用β-actin。使用BeyoECL Plus(P0018)检测蛋白，显影成像。

1.3统计学方法 采用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

Western印迹结果显示，终浓度为250 IU/ml IFNγ刺激体外培养的星形胶质细胞株与未加入IFNγ刺激的空白对照组相比，IRF1及NLRC5的水平显著提高(P<0.05)，见表1，由此可见，IFNγ对星形胶质细胞JAK-STAT细胞信号通路的IRF1及NLRC5的有潜在的调节作用。

表1 Western印迹检测两组IRF1、NLRC5表达比较

与空白对照组比较：1)P<0.05

3 讨 论

IRF1是一种核转录因子(NF)〔3〕。NLRC5蛋白分子表达于细胞质也是一种重要的模式识别受体(PRRs)，参与抑制炎症反应和抗病毒反应〔4〕。二者均是JAK-STAT细胞信号通路的重要信号。NLRC5作为NF-κB和Ⅰ型IFN途径的关键抑制分子，NLRC5能有效调控免疫细胞的活性。本研究显示，IFNγ可以促进星形胶质细胞中JAK-STAT细胞信号通路的IRF1及NLRC5的表达，提示这两个关键蛋白可能参与IFNγ对MS的治疗过程。星形胶质细胞JAK1/STAT3细胞信号通路已经被证实在炎症及出血性疾病中活化，从而在中枢神经系统疾病中被广泛关注〔5〕。

JAK-STAT信号传导的经典模式的优点在于其简单性，因为细胞核中的JAK激活的STAT负责特定的基因激活。许多配体包括生长因子和激素使用相同的STAT转录因子〔6〕。但在细胞、组织和器官水平上发挥不同功能。本研究证实复杂的IFN信号与类固醇激素(SH)/类固醇受体(SR)信号传导具有相似性，都有JAK-STAT信号传导的经典模式的激活。IFN信号传导都涉及复合配体，特异性激活相关基因的启动子，活化的JAK和活化的STAT。它们可能都通过参与特异性基因激活和表观遗传重塑，从而改变MS的进程〔7〕。受体细胞内结构域在结合IFN的C末端中起重要作用，这是我们进一步研究的基础。因此，IFN信号传导的研究提供了对这种信号传导的特异性和MS发展和治疗机制的深入了解。

包括在MS动物模型和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的研究，JAK/STAT途径还参与许多细胞因子信号传导，并且对于免疫应答的发展，调节和终止是关键的靶点〔8〕。 所以，JAK/STAT途径的调节对自身免疫和神经炎症疾病具有重要的病理学意义。参与MS/EAE的许多细胞因子，包括IL-6，IL-12，IL-23，IFNγ和GM-CSF，通过JAK/STAT途径诱导免疫应答。因此，在IFNγ研究的基础上，靶向JAK对治疗神经的自身免疫性炎症已经显示了非常广阔的前景〔9〕。AZD1480处理通过阻止免疫细胞进入大脑，抑制Th1和Th17细胞分化，使骨髓细胞失活，抑制大脑中的STAT活化及减少促炎症的表达，进而控制胶质细胞糖蛋白诱导的经典和非典型脊髓炎模型的病情转归。用AZD1480抑制JAK/STAT途径在MS的多个临床前模型中具有临床功效，表明JAK/STAT途径作为神经炎症疾病的靶标可行性〔10〕。

MS及EAE动物模型的特征是局灶性炎症浸润到中枢神经系统，脱髓鞘病变，轴突损伤及激活免疫细胞和损伤神经元和少突胶质细胞的大量细胞因子的产生，包括IL-12，IL-6，IL-17，IL-21，IL-23，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和IFNγ。JAK/STAT信号通路介导这些细胞因子的生物活性，并且对免疫应答的发展和调节至关重要。JAK/STAT途径在MS/EAE中异常激活，因为细胞因子过量产生，负调节因子如细胞因子信号蛋白抑制因子的表达缺失。除了IFNγ外，特定的JAK/STAT抑制剂已经用于许多MS的临床前模型中，并且证明了对疾病的临床过程和先天性和适应性免疫应答的减弱的有益作用。此外，其他药物如他汀类，醋酸格拉替雷，拉喹莫德和富马酸盐具有有益效果，都有潜在的抑制JAK/STAT途径的作用〔11〕。

CK2是一种高度保守和多效的丝氨酸/苏氨酸激酶，可促进许多促存活和促炎症信号通路，包括PI3K/Akt/mTOR和JAK/STAT。CK2特异性地抑制小鼠和人Th17细胞分化，同时促进Foxp3+调节性T细胞(Tregs)的产生。Th17/Treg轴和Th17细胞的成熟是许多自身免疫性疾病(包括MS)的发病机制的主要促成因素。相关结果表明CK2是Th17/Treg轴和Th17细胞成熟的调节因子，并且表明CK2可以靶向治疗Th17细胞驱动的自身免疫疾病〔12～14〕。miR-141和miR-200a可能是通过诱导Th17细胞分化和抑制向Treg细胞分化而在MS症状进展中的关键miRNA〔15〕。这些miRNA可能抑制Th17细胞分化的负调节因子，从而促进其分化。进一步研究IFNγ对这些miRNA的调节将会更深入的解释IFNγ对MS的治疗机制。总之，本研究结果及相关研究进展提示IFNγ对JAK-STAT细胞信号通路，以及相关miRNA及Th17/Treg的调节，可能成为未来利用IFNγ及其他免疫疗法治疗多发性硬化等自身免疫性疾病的有效的分子靶点。