左卡尼汀对老年大鼠脑缺血再灌注损伤的影响

方浩威 肖圣华

(广东医学院附属厚街医院神经内科，广东 东莞 523945)

脑缺血是一种常见的脑血管疾病，其发病率约占脑血管疾病的75%。大部分的脑缺血是由血栓引起的，因此溶栓治疗是最为有效的治疗方法，但是溶栓治疗的治疗时间窗很窄，只有少数患者能够在发病早期可以接受溶栓治疗，使得缺血区域的血流供应得到恢复，但是随着血流供应的恢复，伴随而来的再灌注损伤仍然影响患者治疗效果〔1,2〕。因此，在临床上迫切需要能够减轻缺血或细胞损伤，延迟或组织神经元死亡，延长缺血耐受时间和治疗时间窗用于治疗或减少缺血再灌注损伤治疗〔3〕。左卡尼汀又名左旋肉碱，是存在于机体中一种特殊的氨基酸，能够促进长链脂肪酸进入线粒体进行β氧化的关键物质。而现代医学研究表明，左卡尼汀可以促进能量代谢，保护线粒体，降低细胞内Ca2+浓度从而起到清除自由基和抗凋亡等作用。目前左卡尼汀广泛用于肝脏疾病、心肌梗死、充血性心力衰竭等疾病〔4,5〕。近年来，左卡尼汀发现可以用于治疗缺血再灌注损伤，受到广泛关注。本研究在老年大鼠缺血再灌注损伤模型中研究左卡尼汀对其作用，旨在寻找左卡尼汀的可能作用机制。

1 材料和方法

1.1实验动物 健康Wistar大鼠，20～22周龄，均为SPF级，均为雄性，由浙江省医学科学院提供，使用许可证号为syxk(浙)2014-0008。大鼠饲养于SPF动物房中，动物房温度维持在20～25℃，相对湿度为30%～60%，自由禁食禁水。12 h照明12 h避光，正式试验前适应新饲养至少1 w。

1.2试剂和仪器 左卡尼汀购自珠亿邦制药有限公司；三磷酸腺苷(ATP)酶试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、环磷酸鸟苷(cGMP)肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自武汉博士德生物技术开发公司。使用TICAN公司生产的E2000型酶标仪。

1.3方法 将36只大鼠根据体重均衡随机分为假手术组、模型组和左卡尼汀组。大鼠仰卧位固定于手术台上，剃毛消毒，于颈部中间部位做2 cm切口，钝性分离肌肉暴露右颈动脉，仔细分离血管和神经，游离出颈外动脉和颈内动脉，结扎颈外动脉和颈动脉近心端，压闭颈内动脉，于颈总动脉下支剪出一切口后置入直径为0.23 mm的PVC软管，组闭2 h后抽出软管，恢复再灌流。假手术组分离颈内外动脉，但不置入软管，其余与模型组一致。左卡尼汀组在进行模型手术前30 min腹腔注射200 mg/kg左卡尼汀。

1.4观察指标 三组动物在恢复再灌注后24 h麻醉，腹主动脉取血，离心后去血清备用。迅速摘取大鼠脑部，并置于液氮中备用。测定血清和脑组织中ATP、MDA和SOD的含量；并通过ELISA试剂盒测定脑组织中NO、NOS、cGMP和TNF-α的水平。神经损伤的评价标准为：无神经功能损伤为0分；大鼠提起尾部不能伸展左侧前爪为1分；动物行走时向左侧转圈为中毒神经功能缺损极为2分；大鼠行走困难或向左侧倾倒为3分；大鼠不能行走为4分。

1.5统计学方法 使用SPSS15.0统计学软件进行单因素方差分析、LSD-t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1左卡尼汀对神经功能评分的影响 模型组恢复再灌注24 h后，神经损伤评分为(2.73±0.85)分，显著高于左卡尼汀组〔(1.52±0.63)分，P<0.05〕。

2.2左卡尼汀对大鼠缺血再灌注损伤后血清炎症指标的影响 模型组大鼠血清SOD、IL-6、MDA与假手术组相比有显著差异(P<0.05)；而TNF-α的水平与假手术组相比无显著差异(P>0.05)；左卡尼汀组与模型组相比，SOD和IL-6含量显著高于模型组；MDA含量显著低于模型组(P<0.05)。见表1。

2.3左卡尼汀对缺血再灌注损伤后大鼠脑组织炎症因子的影响 模型组脑组织MDA和TNF-α显著高于假手术组(P<0.05)；左卡尼汀组与模型组相比，显著降低脑组织中MDA和TNF-α的水平。与假手术组相比，模型组显著降低了SOD和IL-6的水平，而左卡尼汀处理后显著提高了SOD和IL-6的水平(P<0.05)。见表2。

2.4左卡尼汀对缺血再灌注损伤后大鼠脑组织ATP酶、NO、NOS和cGMP含量的影响 模型组NO、NOS和cGMP含量显著高于假手术组(P<0.05)，左卡尼汀组与模型组相比可以显著降低NO、NOS和cGMP的含量(P<0.05)。ATP酶结果表明，模型组脑组织中ATP酶的活力显著低于假手术组，而左卡尼汀组脑组织中ATP酶的活力显著高于假手术组(P<0.05)，见表3。

表1 左卡尼汀对大鼠缺血再灌注损伤后血清炎症因子的影响

与假手术组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05，下表同

表2 左卡尼汀对缺血再灌注损伤后大鼠脑组织炎症因子的影响

表3 左卡尼汀对缺血再灌注损伤后大鼠脑组织ATP酶、NO、NOS和cGMP含量的影响

3 讨 论

正常的血液循环是维持机体组织、细胞保持正常生理功能的基本条件。各种原因所致的组织血液灌流量不足会导致组织局部缺血，导致局部组织能量代谢障碍、活性氧增多，导致局部炎症反应发生，最后炎症反应介导的细胞损伤和细胞凋亡导致组织损伤〔6〕。如何有效预防并积极治疗组织的缺血再灌注损伤是目前临床上急需解决的治疗难题。目前，临床上主流的治疗方法是对缺血组织预处理及在缺血发生前采取相应措施，提高靶区域细胞对缺血和缺氧的耐受程度，并且在缺血后处理及采取短暂的再灌注-缺血交替处理方法，但是不仅操作繁琐，而且往往难以诊断患者是否存在局部缺血风险，难以真正有效实施。最近的研究表明，在缺血-再灌注损伤中，由于线粒体的损伤导致细胞凋亡可能损伤中的关键部位。

因为脑缺血再灌注患者的病情紧急，对患者的危害极大，临床治疗的方式因患者个体差异而存在较大的差异，较难采用临床病例进行脑缺血再灌注相关研究。关于脑缺血再灌注损伤的相关研究多采用动物模型进行试验研究，临床造模脑缺血再灌注的方法较多，以大鼠应用最多。常用的大鼠实验模型有:动脉线栓模型〔7〕三血管阻断(阻断基底动脉和双侧颈总动脉)模型〔8〕、四血管阻断(夹闭双侧颈总动脉并阻断双侧椎动脉)模型〔9〕、夹闭双侧颈总动脉模型、结扎双侧颈总动脉模型〔10〕、夹闭沙土鼠颈总动脉模型〔11〕、动脉引流模型〔12〕等。本文采用较为常用的结扎双侧颈总动脉模型造模。左卡尼汀是脂肪酸代谢过程中必需的氨基酸，能够促进长链脂肪酸进入线粒体中从而发生β氧化，同时具有保护线粒体mtDNA缺失，发挥其神经保护作用〔13，14〕。因此，左卡尼汀在治疗缺血再灌注损伤上的作用是目前关注的重点。

本研究结果表明，左卡尼汀能够降低由于缺血再灌注损伤所引起的血清MDA水平的上升。MDA一般被认为是机体内炎症反应强度的标志，左卡尼汀可以显著降低脑缺血-再灌注损伤大鼠血清MDA水平，可能是其改善大鼠脑缺血再灌注损伤的原因之一。本研究结果表明，左卡尼汀能够显著降低脑组织中MDA的含量，并显著提高SOD水平，表明左卡尼汀具有较强的抗氧化和清除自由基的作用。进一步的研究表明，左卡尼汀能够显著降低脑组织中NO、cGMP和NOS水平。NO是哺乳动物体内普遍存在的一种强生物活性物质，由NOS催化生成，NO在体内有着广泛的生物学效应，其主要是通过下游cGMP产生作用，提示左卡尼汀能够降低NOS、NO和cGMP的含量显著降低缺血再灌注损伤引起的一系列生物学反应〔15，16〕。而且左卡尼汀可能会通过提高脑组织ATP酶的活力，从而降低脑组织细胞中线粒体损伤，减轻大鼠缺血再灌注损伤。

综上所述，左卡尼汀能够显著改善大鼠缺血再灌注损伤模型导致的神经损伤，其作用机制可能是通过降低血清和脑部MDA水平，降低脑部组织中NO、NOS和cGMP水平，提高SOD和ATP酶的活力相关。