补肾通络方对骨质疏松大鼠骨吸收的影响

闵 文 韩 龙 韩诗雨 尚宜志 吴铭杰 方彭华 袁 翰 黄桂成

(南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210023)

骨质疏松(OP)是以骨量减少、骨组织微结构退化为特征，导致骨脆性增加进而易发生骨折的一种全身性骨代谢疾病〔1〕。随着生活水平的提高，人口老龄化日趋明显。流行病学调查显示，我国现有老龄人口约1.3亿,OP患者达8 400万人，预计到2050年，我国老龄人口将达到2.5亿，其中25%～70%可能患有OP〔2〕。绝经后妇女患OP高达40%〔3〕，世界范围内每年因OP引起的骨折有900万例〔4〕。OP已成为亟待解决的严重的社会公共卫生问题。细胞核因子κΒ受体活化因子配体(RANKL)可促进破骨细胞的分化，增强成熟破骨细胞的活力，阻止破骨细胞凋亡，是破骨细胞分化成熟和维持功能所需的重要因子。骨保护素(OPG)蛋白能明显抑制破骨细胞的形成，并引起骨密度(BMD)的升高〔1〕。在骨组织中，OPG作为一种诱骗受体，可以竞争性地与RANKL结合，从而阻止RANKL与破骨细胞表面的RANK结合，抑制破骨细胞的分化成熟〔5，6〕。因此，RANKL/OPG的比值对破骨细胞的分化有着直接影响。补肾通络方是基于临床经验总结及动物实验研究得到的经验方，该方对OP患者及OP大鼠的骨量减少都有改善〔7，8〕。但是，目前对于补肾通络方影响骨吸收的机制尚不明确。本研究通过建立去卵巢OP模型大鼠，观察补肾通络方对大鼠血清白细胞介素(IL)-1、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α及骨代谢相关因子RANKL/OPG的影响，探讨补肾通络方对OP大鼠骨吸收的影响机制。

1 材料与方法

1.1动物及材料 6月龄SD系SPF级雌性大鼠104只，体重260～280 g。动物购于浙江省实验动物中心，许可证号：SCXK(浙)2014-0001。中药：补肾基础方、通络方、补肾通络方均由江苏省中医院制剂室提供，含生药1.0 g/ml。补肾基础方:淫羊藿、骨碎补、续断、茯苓、白芍、甘草等组成。通络方:蜈蚣、全蝎等组成。补肾通络方:淫羊藿、骨碎补、续断、蜈蚣、全蝎、茯苓、白芍、甘草等组成。西药：阿仑膦酸钠、氟化钠。

1.2仪器与试剂 MultiGene Gradient PCR 循环仪(美国Labnet)，HH-4 数显恒温水浴锅(国华电器有限公司) UV-2450，SHIMADZU 紫外光度仪(日本岛津公司)，Western印迹电泳槽、电源(美国Bio-Rad)。凯基全蛋白提取试剂盒，江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20161013。一抗：OPG(H-249)：Santa Cruz Biotechnology，货号：sc-11383；RANKL(C-20)：Santa Cruz Biotechnology，货号：sc-7627；β-actin，北京博奥森生物技术有限公司，货号：bs-0061R。二抗：抗兔IgG，Cell Signaling Technology，#7074；HRP 兔抗山羊，武汉博士德生物工程有限公司，货号：BA1060。

1.3方法

1.3.1模型建立及给药 将大鼠随机分为假手术组和模型组，分别为22只和82只。全部动物按照300 mg/kg水合氯醛腹腔麻醉。用碘伏行皮肤消毒后，用手术剪刀沿后正中线切开皮肤，切口长约2 cm。于肋弓下脊柱旁开1 cm处切开肌肉，打开后腹膜。找到位于肾脏后下方的脂肪团，将卵巢轻柔提出，并分离周围脂肪组织，结扎双侧卵巢下方的输卵管、血管。切除双侧卵巢，放入固定液固定。然后逐层缝合，在每侧手术部位注射青霉素1 ml。假手术组仅切除双侧卵巢旁部分脂肪，余处理同模型组。术后每天青霉素钠盐，连续3 d。术后70 d从两组分别随机选出10只大鼠处死后取右侧股骨，去除附着肌肉和结缔组织，采用双能 X 射线骨密度(BMD)仪进行检测，以验证造模是否成功。造模成功后，假手术组剩下 12 只，模型组大鼠随机分为6组：模型组、补肾基础组、通络组、补肾通络组、阿仑膦酸钠组、氟化钠组各12只。给予补肾通络组6.3 g/kg、补肾基础组5.4 g/kg、通络组0.9 g/kg水提液灌胃〔8〕，阿仑膦酸钠组1 mg/kg，氟化钠组5 mg/kg药物溶解液。1次/d，共70 d。

1.3.2取材及样本处理 给药结束后，动物空腹12 h，采用7%水合氯醛(300 mg/kg)进行腹腔麻醉。待麻醉生效后，用5 ml一次性注射器从大鼠腹主动脉抽取血液，转入血液采集管，标记及记录。接着取出大鼠股骨，剔除软组织及骨膜，用4℃预冷的生理盐水冲洗干净后，用铝箔纸包裹并标记，放入-80℃中冻存。

1.3.3血清学检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检查血清IL-1、IL-6、TNF-α。

1.3.4BMD检测 采用双能X线吸收法测定BMD。

1.3.5Western印迹法检测骨组织RANKL/OPG蛋白的表达 用液氮将骨组织研磨至粉末状，将粉末转入预冷的离心管，按0.2 g/ml的比例加入裂解液剧烈震荡，以使组织充分裂解。3 000 r/min离心，取上清得到骨组织蛋白。通过氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法测得其浓度。依据所得蛋白浓度调整煮样的浓度，然后，12%分离胶中加入30 μg样品。接着将分离的蛋白转到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；室温封闭2 h；一抗4℃过夜，次日1×TBST洗3次，每次10 min；然后室温孵育二抗2 h。最后，通过超敏发光液看到免疫反应条带并且通过Bio-Rad软件定量。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析及χ2检验。

2 结 果

2.1各组血清IL-1、IL-6、TNF-α水平比较 与假手术组相比，模型组IL-1、IL-6明显增加(P<0.05)。与模型组相比，阿仑膦酸钠组、氟化钠组、补肾通络组及通络组IL-1、IL-6均显著减少(P<0.01),补肾基础组无明显变化(P>0.05)。与假手术组相比，模型组大鼠TNF-α显著增加(P<0.01)。与模型组相比，阿仑膦酸钠组、氟化钠组、补肾通络组及补肾基础组TNF-α均明显减少(P<0.05)，通络组TNF-α显著减少(P<0.01)。见表1。

2.2各组BMD水平比较 与假手术组相比，模型组BMD显著减少(P<0.01)。与模型组相比，阿仑膦酸钠组和补肾通络组BMD均显著增加(P<0.01),氟化钠组、通络组及补肾基础组BMD均明显增加(P<0.05)，见表2。

2.3检测各组RANKL/OPG蛋白表达水平比较 与假手术组相比，模型组RANKL/OPG蛋白比值显著增加(P<0.01)。与模型组相比，阿仑膦酸钠组和补肾基础组RANKL/OPG蛋白比值均明显减少(P<0.05),氟化钠组、补肾通络组及通络组RANKL/OPG蛋白比值均显著减少(P<0.01)，见表2，图1。

表1 各组血清IL-1、IL-6、TNF-α水平比较

与假手术组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.05，4)P<0.01;下表同

表2 各组RANKL/OPG蛋白表达水平比较

图1 Western印迹检测各组RANKL/OPG蛋白表达

3 讨 论

中医自古就有“七七任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子”、“精伤则骨酸痿厥”、“肾虚则骨枯髓减”等论述，表明绝经后骨质疏松症以“肾虚-本痿”为根本病机，属“骨痿”范畴。临床上从“骨痿”论治绝经后骨质疏松症，其疗效确切。遵循“欲壮其骨，当补其肾”治则，左归丸、右归丸、二至丸等补肾经方及补肾为主的骨康胶囊、骨疏康颗粒、仙灵骨葆片等临床验方〔9～15〕，均有效治疗绝经后骨质疏松症和降低骨折风险。本研究显示，与假手术对照组相比，骨质疏松模型组大鼠实验前后骨密度显著减少。与之前研究一致，阿仑膦酸钠能够显著增加骨质疏松模型大鼠骨密度。本文发现，补肾中药组、通络药组及补肾通络方组骨密度均明显增加,尤其要指出的是，补肾通络方组骨密度增加优于补肾中药组以及通络药组，这些研究提示补肾通络方及方中两药协同增加骨密度，具有治疗骨质疏松效果。

全蝎、蜈蚣等虫类药是最具代表性的通络中药，善于“搜剔络中混处之邪”，对骨质疏松症、骨关节炎等骨性顽痹疗效显著〔16〕。早在《神农本草经》中就有关于全蝎、水蛭、僵蚕等虫类药记载。张仲景认为虫类药对深伏经络之邪具有草木之药不可比拟的治疗优势，并首创虫类搜剔通络法。现代药理研究发现，全蝎、蜈蚣等虫类药透骨搜邪和通络止痛功效是通过抑制TNF-α、 IL-1、IL-6等致炎因子实现，而这些致炎因子广泛作用于绝经后骨质疏松症骨形成/骨吸收病理过程〔17～19〕。本实验结果发现，补肾中药组、通络中药组及补肾通络方组均能够降低骨质疏松模型大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α显著降低，提示补肾通络方及方中两药能够抑制炎性因子表达，尤其是通络药抑炎效果显著，从而导致骨吸收过程明显减少，提高骨密度。

OPG/RANK/RANKL信号通路是调节骨重建过程中破骨细胞功能的重要通路。成骨细胞释放的RANKL与破骨细胞表面的RANK结合后通过NF-Kb途径、JNK途径、蛋白激酶B途径等促进破骨细胞的分化和激活;OPG则可竞争性抑制RANK与RANKL的结合,抑制破骨细胞功能,减少骨吸收〔20〕。因此，RANKL/OPG蛋白比值与骨量及骨密度呈负相关。本次研究结果显示，阿仑膦酸钠组、氟化钠组、补肾中药组、通络中药组及补肾通络方组RANKL/OPG蛋白比值均显著下降。实验已证实可以降低RANKL/OPG蛋白比值，抑制破骨细胞增殖活化，减少骨吸收〔9,21〕。此外，通络中药组及补肾通络方组RANKL/OPG均显著减少，提示通络中药及补肾通络方中两药能够协同降低RANKL/OPG蛋白比例，抑制破骨细胞增殖活化，减少骨吸收，增加骨密度，逆转骨质疏松症。因此，通络法及虫类通络中药是“补肾”治疗的必要补充。