依达拉奉联合雷帕霉素对蛛网膜下腔出血大鼠神经细胞自噬及学习记忆的影响

安朝旺 王 峥 李建民 赵雅宁 付爱军 黄海玲

(华北理工大学附属医院神经外科，河北 唐山 063000)

研究发现自噬参与蛛网膜下腔出血(SAH)的早期脑损伤(EBI)病理进程，决定EBI阶段神经细胞的转归：恢复或修复、加重或死亡〔1〕。雷帕霉素(RAP)是一种新型的大环内酯类免疫抑制剂，可特异性抑制雷帕霉素靶蛋白(mTOR)激活，调控基因的转录和蛋白的表达，进而影响细胞自噬进程〔2〕。依达拉奉是2001年上市的氧自由基清除剂，被广泛应用于脑梗死、急性脑出血等疾病的救治〔3，4〕。目前有关RAP 和依达拉奉对SAH保护机制的研究不多。本研究建立SAH动物模型，应用依达拉奉联合RAP进行干预，观察自噬关键因子Beclin-1和微管相关蛋白1(轻链LC3)-Ⅱ表达及动物学习记忆恢复情况，分析RAP和依达拉奉对SAH神经保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1动物分组与模型制作 清洁级雄性SD大鼠80只，体重350～450 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司〔动物合格证号为SCXK(京)2009-003〕，分为假手术组、SAH组、RAP组和依达拉奉联合RAP组(联合组)。每组分为24 h、48 h、72 h 和144 h四个时间亚组。模型制作〔5〕采用经典的二次注血法(向枕大池注射自体动脉血0.3 ml，二次间隔时间为48 h)制备大鼠蛛网膜下腔出血的模型。假手术组向枕大池两次注入0.3 ml生理盐水，余操作均与SAH组一致。模型成功判定标准：①当进行二次枕大池注血时，可见少量血性脑脊液在穿刺部位渗出；②剥离脑部时肉眼显见血性液体散在分布在脑底基底池部位。RAP组：SAH模型制备成功后即刻经腹腔注射100 μg/kg，每24 h给药1次；联合组在RAP组基础上经尾静脉注射依达拉奉，10 mg/kg，每24 h给药1次。

1.2动物学习记忆检测 分别伤后第72小时和144小时采用Morris水迷宫进行检测，上午、下午各1次，记录各组搜索安全岛潜伏期时间和撤掉平台后大鼠穿越原平台位置的次数，取检测记录的总均值。

1.3脑组织海马区形态结构观察 每组各时间点取5只大鼠，常规麻醉后，处死动物，用4%多聚甲醛灌注固定后，石蜡包埋、冠状切片，HE染色，400倍光学显微镜下观察海马区神经细胞形态结构。计数每个视野存活神经细胞数量，具体方法：每只大鼠取4张海马区切片，每张切片选取5个不重复的视野(共100个视野)，选Motic-6.0图像采集及分析系统分析，以每个视野下平均细胞百分率(400×)下CA1区存活细胞数量与总细胞数量比值表示。

1.4免疫组织化学法检测Beclin-1和LC3-Ⅱ阳性表达 脑组织标本采集方法同HE染色，脑组织切片常规脱蜡至水，37 ℃温箱中孵育20 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3 次，每次5 min，用3%H2O2封闭15 min，PBS洗涤3×5 min，滴加兔抗鼠Beclin-1和LC3-Ⅱ多克隆抗体(1∶200，1∶200，1∶250)，4℃过夜；37℃复温45 min，PBS洗涤3×5 min，滴加二抗，37 ℃温箱中孵育40 min，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素轻度复染、脱水透明、封片。镜下观察并摄片。阳性率的定量分析：每个标本取4张切片，将每张切片的CA1区平均分为3个等份，每个等份选取一个相同部位的4个视野，应用Motic-6.0图像采集及图像分析系统分析各组阳性细胞进行吸光度。

1.5统计学处理 应用SPSS17.0 统计分析软件进行方差分析及SNK-q分析。

2 结 果

2.1各组学习记忆能力 与假手术组比较，SAH组各时间点逃避潜伏期明显延长、穿台次数明显减少；与SAH组比较，RAP组各时间点逃避潜伏期时间明显缩短、穿台次数增多；与RAP组比较，联合组逃避潜伏期时间明显缩短、穿台次数明显增多(均P<0.05)。见表1。

2.2各组海马区神经元形态学变化 假手术组海马区神经细胞结构正常、排列整齐。SAH组海马区可见较多坏死神经细胞，表现为细胞核溶解、核碎裂，或细胞正常结构消失；与假手术组比较，SAH组各时间点神经细胞存活率均明显减少(P<0.05)。RAP组神经细胞形态结构损伤减轻，与SAH组比较，视野中存活神经细胞明显增多(P<0.05)；联合组神经细胞形态结构损伤进一步减轻，各时间点神经元存活率均明显增多(P<0.05)。见图1、表2。

2.3各组海马区Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫组织化学检测结果 Beclin-1和LC3-Ⅱ阳性表达主要位于细胞核。假手术组海马区有少量的阳性细胞，染色较淡；与假手术组比较，SAH 组Beclin-1和LC3-Ⅱ阳性细胞染色棕黄，免疫阳性反应明显增强(P<0.05)；与SAH组比较，RAP组Beclin-1和LC3-Ⅱ阳性细胞染色棕黄，免疫阳性反应明显增强(P<0.05)；联合组神Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫阳性反应进一步增强(P<0.05)。见表3、表4、图2。

表1 各组逃避潜伏期和穿台次数比较

与假手术组比较：1)P<0.05；与SAH比较：2)P<0.05；与RAP组比较：3)P<0.05，下表同

图1 各组大鼠72 h海马区组织病理形态的变化(HE，×400)

表2 各组海马区神经细胞存活率比较

图2 各组72 h海马区Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫组织化学结果(DAB,×400)

表3 各组海马区Beclin-1相对表达量比较

表4 各组海马区LC3-Ⅱ相对表达量比较

3 讨 论

本研究发现RAP可减少SAH大鼠海马区神经细胞死亡，降低动物学习记忆障碍，提示RAP对SAH的EBI有一定保护作用。RAP具有抗炎、免疫调节作用，临床上主要用来协助器官移植术后的抗免疫治疗〔6，7〕。近年研究显示RAP具有一定的神经保护作用，可阻断细胞内复合物1的活性导致ATP的损耗和细胞内氧自由基生成过多，拮抗神经退行性病变如帕金森病、阿尔茨海默病进程中神经细胞的凋亡〔8，9〕。动物实验证实RAP可通过作用于其靶蛋白mTOR抑制其活性，进而调控细胞周期、减少能量的耗损，降低促凋亡蛋白表达，以促进应激状态下细胞的存活〔10〕。RAP通过抑制mTOR激活，促进自噬已被证实〔11〕。脑损伤状态下，自噬激活能清除细胞内受损细胞器、调节细胞能量代谢、减轻细胞损伤程度；但自噬过度可以促进Caspase-3裂解，加重神经细胞死亡〔12〕。本研究中RAP组自噬标记蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ表达增加，此时神经细胞存活率增加，动物学习记忆损伤情况，一方面说明SAH的EBI阶段自噬激活具有神经保护作用，也说明RAP通过增强EBI阶段的自噬程度而发挥对SAH的神经保护作用。

本研究发现依达拉奉对SAH有很好的保护作用。SAH后颅内血液积聚、凝固血块压迫造成缺血缺氧、积聚的血红细胞裂解使氧合血红蛋白进一步释放超氧阴离子和生成羟基自由基，使氧自由基生成增加等，诱导强烈氧化应激反应，神经细胞损伤加重〔13，14〕。神经保护剂依达拉奉主要通过清除氧自由基、减轻氧化应激导致的一系列级联反应而防治脑损伤的持续进展，这是本研究中联合组中存活神经细胞数量、动物学习记忆情况均进一步改善的主要原因。本研究中联合组Beclin-1和LC3-Ⅱ表达增加进一步增高，提示依达拉奉可强化RAP对SAH后自噬活性的调控。研究发现氧自由基可激活自噬，且与mTOR途径〔15〕；而依达拉奉可清除大量的氧自由基，使机体氧自由基水平保持在一定水平，从而维持SAH后自噬水平适度表达〔16〕。