外周血Th22/Treg细胞在多发性硬化患者中的水平及与严重程度的关系

甄 瑾 马翔凌 田晓艳 丁海涛 傅永旺 李 攀

(内蒙古自治区人民医院神经内科，内蒙古 呼和浩特 010017)

多发性硬化(MS)是以中枢神经系统白质脱髓鞘为特征的自身免疫性疾病，神经中枢斑片状的炎性浸润及脱髓鞘是MS的主要病理表现〔1〕。MS病灶播散广泛且临床症状较为复杂多变，发病机制尚未完全阐明，目前普遍认为T淋巴细胞介导的免疫应答在MS的发病过程中有重要作用。传统观点认为，Th1细胞及巨噬细胞是引起白质脱髓鞘的主要原因〔2〕，然而近年来不断有研究表明，Th22细胞、调节性T细胞(Treg)及自然杀伤(NK)细胞等具有免疫调控功能的细胞及其相关细胞因子均在MS的发生过程中起重要作用〔3,4〕。本研究着重对MS患者的Th22、Treg细胞进行分析，并对相关细胞因子白细胞介素(IL)-22、IL-35进行检测，旨在研究Th22/Treg细胞在MS发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年1月至2016年2月在内蒙古自治区人民医院就诊的复发缓解型MS(RR-MS)急性期患者39例为MS组，男14例，女25例，年龄25～61岁，平均(48.34±5.28)岁，病程0.8～12.0年，平均(5.56±3.20)年；健康体检者35例作为对照组，男14例，女21例，年龄27～60岁，平均(47.16±4.87)岁。两组研究对象的年龄、性别差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

MS组纳入标准：①符合2010年MacDonald标准中的RR-MS型诊断标准〔5〕；②入院前3个月内未使用免疫调节剂或糖皮质激素；③出现不同程度神经系统阳性症状。排除标准：①合并患有其他免疫性疾病者；②有脑梗死或脑出血等脑部或中枢神经系统疾病；③发生严重感染，有重度炎症；④高血压、糖尿病及肝功能异常患者。对照组均无免疫类疾病史。

本研究课题已获伦理委员会批准，所有入组对象签署知情同意书。

1.2外周血中Th22和Treg细胞检测 (1)样品采集：空腹抽取所有研究对象的外周静脉血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，采用Ficoll分层密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，并调整细胞浓度为1×106个/ml。(2)Th22细胞检测：在调整后的细胞悬液中加入佛波酯(PMA)、莫能霉素及离子霉素于37℃、5%CO2培养箱中培养4 h；用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，加入PETC-CD4抗体，4℃避光放置，孵育30 min；固定破膜后加入PE-IL-22抗体，4℃继续避光孵育30 min，采用FACSCanto Ⅱ流式细胞仪进行检测，结果采用FACS Diva7.0软件进行处理，以Th22细胞所占CD4+T细胞的比例表示Th22细胞水平。(3)Treg细胞检测：取已调整浓度的外周血，加入PETC-CD4抗体和APC-CD25抗体，4℃避光孵育30 min；固定破膜后加入转录因子叉头蛋白(Foxp)3封闭剂封闭5 min；加入PE-Foxp3抗体，4℃继续避光孵育2 h，检测方法同Th22细胞。

1.3血浆中IL-22和IL-35的测定 空腹采集静脉血5 ml，采用肝素抗凝，3 000 r/min离心15 min，收集血清于无菌0.5 ml EP管中，-20℃保存待检。采用双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清IL-22和IL-35表达水平。所有操作严格按照试剂盒说明进行，试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.4MS患者病情评估 根据Kurtzke的EDSS评估量表〔6〕，从运动、感觉、认知、言语、自主神经及心理与神经功能等方面对患者的病情进行评估，分值从正常的0分到严重缺损的9分不等。

1.5统计学分析 采用SPSS19.0软件，计量资料采用独立样本t检验和Spearman非参数检验，等级资料采用秩和检验。

2 结 果

2.1两组外周血中Th22、Treg细胞的比较 与对照组相比，MS组外周血中Th22细胞所占比例升高，Treg细胞所占比例下降，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组外周血中Th22、Treg细胞百分比比较

2.2两组血浆中IL-22和IL-35的表达水平比较 MS组IL-22的表达显著高于对照组(P<0.05)，IL-35水平显著低于对照组(P<0.05)，差异均有统计学意义，见表2。

表2 两组血浆中IL-22和IL-35的表达水平比较

2.3Th22细胞和Treg细胞与MS患者病情的关系 MS组EDSS评分为0.0～8.5分，平均(3.09±0.87)分。随着EDSS评分升高，MS伤残程度逐渐严重，外周血中Th22细胞所占比例不断增加，Treg细胞所占比例不断减少，且两种细胞在不同EDSS评分的组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。MS患者外周血中Th22细胞与Treg细胞所占百分比无明显相关性(r=-0.222,P=0.445)。

表3 不同程度MS患者外周血中Th22和Treg细胞比例分布

3 讨 论

MS发生原因主要是自身免疫系统攻击神经中枢，引起神经轴突的髓鞘蛋白发生免疫反应，造成脱髓鞘，甚至神经元和轴索遭到破坏，最终导致神经传导受阻进而造成残疾。MS是一种炎性疾病，因此，介导机体免疫反应及炎性因子分泌的淋巴细胞成为MS发生发展的主要研究对象。在MS发病机制研究中，早期认为Th1细胞是MS的主要致病淋巴细胞，其在炎症部位高表达，由Th1细胞分泌的干扰素(IFN)-γ、转化生长因子(TGF)-β等促使炎症反应加重，导致组织损伤加重〔7〕。然而，随着Th17细胞的发现，改变了有关MS发病机制的传统观念，不断有研究显示不仅Th1/Th2细胞在MS中发挥作用，Th17、Th22、Treg及记忆T细胞等均有与MS相关性的报道〔8〕。

Th22细胞是由Schmidt等发现的以IL-22为主要标志因子，独立于Th1、Th2及Th17的CD4+T细胞亚群。Th22细胞是一种稳定的淋巴细胞亚群，不易向其他亚群分化，主要分泌IL-22、TNF-α及IL-10，其中机体内的IL-22有37%～63%由Th22细胞分泌〔9〕。IL-22属于IL-10家族的一员，主要依靠IL-10R2及IL-22R1发挥作用，在体内能够激活酪氨酸激酶/信号转导及转录激活因子(JAK/STAT)通路和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的三条细胞信号通路。有关Th22细胞在免疫性疾病中的调控机制尚不完全明确，但有研究表明在不同程度的疾病中Th22细胞的比例及IL-22的表达量均不相同。刘立民等〔10〕研究指出在原发性免疫性血小板减少症患者外周血中，Th22细胞的比例显著高于正常组，经药物治疗后细胞比例有所下降，说明Th22细胞在免疫性疾病中发挥免疫促进作用，加重疾病进程。Perriard等〔11〕表明，不同MS分型患者脑脊液及血液中IL-22和受体结合蛋白的核酸及蛋白水平均高于正常组，且IL-22可以提高星形胶质细胞的存活率。星形胶质细胞是中枢神经中含量最多的胶质细胞，有研究显示星形胶质细胞在MS中的活化或增生会导致机体产生神经损伤因子，加速MS的发生发展〔12〕。本文与上述观点一致，再次说明Th22细胞及相关细胞因子IL-22与MS密切相关。

Treg细胞是体内具有免疫抑制功能的T细胞，表型为CD4+CD5+，研究表明只有CD4+CD5high具有免疫调节功能，而CD4+CD5int作为活化的效应T系统无免疫抑制活性，因此Treg细胞在体内的抑制水平与细胞数量及抑制活性有关。翁益云等〔13〕在MS患者外周血CD4+CD5+T细胞检测中发现，其数量与正常组无显著差异，但在活动期效应T细胞的数量显著增加，且Foxp3 mRNA表达显著降低。FOXP3是特异性表达于Treg细胞的转录因子，在Treg细胞发挥免疫抑制活性中起重要作用，多数研究证实其在免疫性疾病中表达降低〔14〕。IL-35是至今发现的唯一一个由Treg细胞分泌且具有限制机体过度免疫应答作用的细胞因子，能够上调IFN-γ，进而抑制TGF-β诱导的Th17细胞的分化。有研究表明，MS组脑脊液中IL-35水平显著高于非炎性神经系统疾病患者，且MS复发期IL-35的表达明显低于缓解期，具有反馈性抗炎作用〔15〕。结合本研究结果，说明机体Treg细胞和IL-35下降，进而导致机体相关免疫抑制活性下降，可能是MS发生的原因之一。

综上所述，患者外周血中Th22细胞百分比升高和Treg细胞百分比下降，引起胞内相关细胞因子表达水平改变，使得机体免疫应答增强，免疫抑制功能减弱，进而加重炎症反应导致炎性细胞浸润、髓鞘破坏可能是导致MS发生发展的主要原因。针对以上发病机制，可以在临床研究中以此作为靶点，采取不同的措施，干预机体免疫应答，以期缓解病情，为MS的治疗提供重要的临床依据。