泛醌细胞色素C还原酶核心蛋白1基因甲基化与阿尔茨海默病发病风险的相关性

王 静 赵 晴 徐亚南 孔祥怡 丛乐乐 李松涛

(吉林大学中日联谊医院，吉林 长春 130033)

阿尔茨海默病(AD)是老年人认知功能障碍最常见的痴呆类型〔1〕，其特征在于不可逆的记忆丧失和认知能力下降〔2〕。AD的发病受诸多因素的影响，其中表观遗传学在AD的发病早期发挥重要作用〔3,4〕。DNA甲基化是基因调控常见的表观遗传学之一，近几年的研究检测到AD患者体内多个AD相关基因的甲基化水平与正常人存在明显差异〔5〕，外周血中基因甲基化有可能成为早期诊断AD的指标。泛醌细胞色素C还原酶核心蛋白(UQCRC)1基因是编码线粒体呼吸作用复合体Ⅲ(呼吸链的重要组成部分)的一个亚基,线粒体功能障碍在AD发病过程中起着关键作用,当UQCRC1基因发生甲基化时可能造成线粒体呼吸链功能障碍，与AD的发病可能有一定的关系。本研究分析AD患者外周血中UQCRC1基因甲基化状态，旨在探讨UQCRC1基因启动子区甲基化与AD发病风险的相关性，以期寻找可以早期诊断AD的检测方法，同时为AD提供一个新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验对象 AD组选取2015年9月至2016年12月吉林大学中日联谊医院神经内科记忆障碍门诊及住院部收治的老年AD患者，同时选取吉林大学中日联谊医院体检中心与AD组年龄、教育程度、血压、身体基本情况等基线资料相匹配的非AD患者为对照组。研究对象共105例，AD组50例，对照组55例。两组一般资料包括性别、年龄、高血压、糖尿病史、饮酒史、高密度脂蛋白、吸烟史、同型半胱氨酸、纤维蛋白原、低密度脂蛋白、谷草转氨酶、载脂蛋白A1、谷丙转氨酶、肌酐、总胆固醇、空腹血糖、三酰甘油、叶酸、载脂蛋白B 等比较，未发现差异有统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。吉林大学中日联谊医院伦理委员会已批准本研究，所有研究对象签署知情同意书。AD诊断标准：采用美国精神病学会的精神障碍诊断和统计手册第4修订版(DSM-Ⅳ)中AD的诊断标准〔6〕。排除标准：(1)伴严重的肝、肾、心、肺功能障碍的患者；(2)伴重度的内分泌系统疾病及严重感染性疾病和中毒性脑病的患者；(3)抑郁症患者；(4)有精神病史，先天性精神发育迟缓；(5)有脑卒中、头部创伤史患者；(6)有吸毒史。

1.1.2主要试剂及仪器 全基因组DNA提取试剂盒购自promega公司；EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit(59824)和EpiTect MSP Kit(206143)购自QIAGEN公司；DNA Marker、上样缓冲液购自Takara公司；琼脂糖购自Invitrogen公司；无水乙醇、异丙醇、70%乙醇购自北京化工；TAE(1×)、绿如蓝染料、1.5 ml无菌微型离心管、无菌移液头购自上海生工；台式低温高速离心机、恒温水浴锅、实时定量PCR仪、电泳仪、超低温冰箱、全自动凝胶成像系统、微量加样器、分析天平、台式离心机、涡旋振荡器由吉林大学中日联谊医院科研中心提供； UQCRC1基因甲基化引物、非甲基化引物通过MethPrimer软件设计，由上海生工合成；引物序列：UQCRC1甲基化引物：上游5'GTT TTA AGT GAT TTA TTT GTT TCG G3′，下游5′TTT CTC CAT ATT AAC CAA TTT TAC G3′，扩增长度131 bp；UQCRC1非甲基化引物：上游5'GTT TTA AGT GAT TTA TTT GTT TTG G3′，下游5′ATT TCT CCA TAT TAA CCA ATT TTA CAC3′，扩增长度132 bp。

1.2DNA的提取、DNA亚硫酸氢盐修饰、甲基化特异性PCR(MSP) 于清晨空腹应用EDTA抗凝管采血8 ml，3 000 r/min离心10 min，吸取中间白细胞层，分装在与实验样本对应编号的1.5 ml Eppendoff管，于吉林大学中日联谊医院组织标本库-80℃冰箱保存待用；集中检测。首先解冻-80℃白细胞样品(白细胞/红细胞混合物)，严格按照DNA提取试剂盒操作说明书提取DNA样品，然后严格按EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit(59824)操作说明书对提取的纯度较高的DNA样品进行亚硫酸氢盐修饰，最后采用UQCRC1基因甲基化引物及非甲基化引物进行PCR扩增。PCR反应总体积为25 μl，包括EpiTect Master Mix 12.5 μl，上游引物及下游引物各0.5 μl,亚硫酸氢盐修饰后的DNA模板1 μl，RNase-free水10.5 μl。PCR扩增条件：预变性95℃，10 min；扩增(40个循环)：变性94℃，15 s；退火50℃，30 s；延伸：72℃，30 s；最后延伸：72℃，10 min。PCR扩增的结果，利用凝胶电泳及凝胶成像系统进行检测，如果UQCRC1基因发生甲基化，以甲基化引物扩增的PCR产物出现条带；如果未发生甲基化，以非甲基化引物扩增的PCR产物出现条带。

表1 AD组与对照组一般资料比较

1.3统计学分析 采用SPSS22.0软件行t检验，进行t检验前对计量资料进行方差齐性检验，UQCRC1基因甲基化与AD相关性分析采用χ2检验。

2 结 果

2.1MSP法检测基因甲基化 AD组中样本1、样本2由甲基化引物扩增的产物出现相应条带，说明样本1和样本2发生甲基化改变。对照组中样本1由非甲基化引物扩增的产物出现相应的条带，说明对照组样本1未发生甲基化改变；对照组样本2由甲基化引物扩增的产物出现相应条带，说明样本2发生甲基化。见图1。

Marker:2 000 bp DNA； U:非甲基化 M:甲基化图1 AD组与对照组凝胶电泳

2.2AD组与对照组甲基化结果 AD组中有32例(64.00%)发生甲基化，对照组中有14例(25.45%)发生甲基化，两组甲基化率比较差异具有统计学意义(χ2=15.807，P<0.05)。

2.3在AD组中UQCRC1基因甲基化按性别、年龄分层比较 对AD组进一步按性别、年龄分组，发现UQCRC1基因甲基化与性别无关，差异无统计学意义〔男性甲基化16例(61.54%，16/26)，女性为16例(66.67%，16/24)，χ2=0.142，P>0.05〕，与年龄有关，年龄可能为其危险因素〔≥65岁组甲基化29例(74.36%，29/39)，<65岁组为3例(27.27%，3/11)，χ2=8.256,P<0.05〕。

3 讨 论

研究表明：DNA甲基化介导的调节在包括AD在内的几种慢性神经退行性疾病的发展中起关键作用〔7〕。DNA甲基化是AD非常重要的表观遗传学机制，它通常表现为通过DNA的甲基化抑制基因的表达〔8〕。Smith等〔9〕研究发现位于髓细胞触发受体(TREM)2基因转录起始位点上游289 bp的CpG位点在AD患者大脑的颞上回呈现高甲基化状态。在一项中国人群的研究发现UQCRC1基因在AD患者中高度甲基化，甲基化率高达97.3%〔10〕。国外的一项前瞻性研究分析表明AD易感基因的甲基化水平与AD病理改变相关，并且附近基因的表达水平也发生了改变，例如ATP-结合盒A7基因(ABCA7)和桥连整合蛋白(BIN)1基因〔11〕。Ji等〔12〕研究发现κ阿片受体(OPRK)1基因启动区甲基化与AD发病的风险显著相关。随着基因检测技术的提高，越来越多与AD相关的易感基因被发现，其中一些易感基因的甲基化状态与AD的发生发展高度相关〔13，14〕，未来希望建立一个AD易感基因谱。

目前关于AD的发病机制中，线粒体级联假说受到越来越多人的关注。有研究报道脑内的线粒体功能和葡萄糖代谢的改变是导致AD发病的前因，正电子发射断层摄影术(PET)检查显示AD患者脑组织氧化和能量代谢受损，AD患者脑部对葡萄糖的吸收和利用与正常人相比减少21%～28%〔15〕。Swerdlow等〔16〕研究发现AD患者的脑组织存在Tau蛋白磷酸化、细胞周期重返和淀粉样变性可能为线粒体功能障碍引起，可以很好地解释非孟德尔遗传因素导致的非常染色体显性遗传性AD的发病。线粒体功能障碍的特征在于缺乏关键呼吸酶的活性并且伴随着活性氧的产生和积累。随着β淀粉样蛋白(Aβ)积聚，它会损害脑血流量，导致更少的葡萄糖可用于能量消耗，继续恶性循环会加剧受损的脑血流量并导致神经元变性，最终导致AD的发病〔17～19〕。Mancuso等〔20〕研究发现AD患者脑组织中线粒体电子传递链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表达都下降，细胞色素C氧化酶活性降低。有研究表明，在神经纤维缠结形成之前，线粒体内细胞色素C氧化酶与线粒体DNA的水平有所改变，线粒体异常是AD病理的早期特征〔21〕。 Sorrentino等〔22〕利用线虫和小鼠作为模式生物，发现提高线粒体抵抗特定蛋白的应激能力，能够让他们不仅保护自我，而且也会降低淀粉样蛋白斑块的形成。研究发现具有各种载脂蛋白E4等位基因的AD患者有线粒体功能障碍〔23,24〕。以上研究说明线粒体功能障碍可能在AD的发生发展中起重要作用。UQCRC1是编码线粒体呼吸作用复合体Ⅲ(呼吸链的重要组成部分)的一个亚基，对维护线粒体正常功能至关重要。以往研究表明UQCRC1基因甲基化与肿瘤关系密切，如乳腺癌、卵巢癌及骨肉瘤、结肠癌等〔25〕。随着线粒体级联假说深入的研究，UQCRC1基因甲基化与AD的关系也获得了研究人员的关注。Ma等〔10〕的一项研究表明UQCRC1甲基化与AD发病风险显著相关。Lardenoije等〔26〕研究了几种AD动物模型中DNA甲基化和年龄的相关性，发现年龄相关的DNA甲基化增加。性别是AD发病风险的一个重要因素，部分原因是因为绝经后女性失去了雌激素对神经元线粒体抗Aβ毒性的保护作用。研究发现老年女性比年龄相当的男性更容易患糖尿病和肥胖等代谢性疾病，增加患AD的风险〔27〕。目前关于性别与UQCRC1基因甲基化相关性未见报道，本实验性别与UQCRC1基因甲基化水平无相关性，而在 Lardenoije等〔26〕的动物模型中，发现在3XTg-AD小鼠模型中基因甲基化与年龄之间显著相关,由于本实验样本量有限，需要更多的实验研究阐明性别对表观遗传变化的影响。