HER2及CD44v6在膀胱尿路上皮癌中的表达及意义

黎美仁 路名芝 郑美蓉 周 燕

(九江学院附属医院病理科，江西 九江 332000)

传统对于膀胱尿路上皮癌(UCB)患者的治疗，常采用化疗、手术切除或是二者结合，随着大家对UCB发病机制及其生物学行为研究的不断深入，人们把更多的目光投向了以特异性及敏感性高而不良反应少的分子靶向治疗。注射用曲妥珠单抗(赫赛汀)在HER2阳性的乳腺癌治疗中的巨大成功，让同样存在HER2蛋白过表达UCB值得期待，同时UCB中CD44v6异常表达，因此，本研究应用免疫组化及荧光原位杂交方法，对UCB中HER2及CD44v6的表达情况进行检测，分析HER2、CD44v6与UCB的临床病理关系。

1 材料与方法

1.1材料 收集2005～2014年九江学院临床医学院/附属医院病理科手术切除UCB组织标本115例。标本类型包括：膀胱全切及膀胱部分切除标本。其中男88例，女27例；年龄31～83(中位65)岁，年龄≥60岁者76例，<60岁者39例；肿瘤直径≥2 cm者45例，<2 cm者70例，参照2004年版世界卫生组织泌尿系统病理学和遗传学诊断标准，高级别57例，低级别58例；存在肌层浸润者34例，无肌层浸润者81例；复发者46例，初发者69例；取同期手术的低度恶性潜能的乳头状尿路上皮肿瘤50例、慢性膀胱炎30例。每例标本的病理组织学诊断都经过两位有主治医师及以上的病理医师重新复片、审核。

1.2试剂 浓缩型兔抗人HER2/c-erbB-2单克隆抗体(工作浓度，北京中杉金桥生物公司，克隆号：EP3)；浓缩型兔抗人CD44v6单克隆抗体(工作浓度，福州迈新生物公司，克隆号8F10)；HER2基因扩增检测试剂盒(北京金菩嘉医疗科技公司)；MaxVision试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂均购自福州迈新生物公司。

1.3方法 所有标本经10%中性缓冲甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm，于二甲苯及梯度乙醇溶液中脱蜡水洗。免疫组化采用MaxVision法，应用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，已知阳性片作为阳性对照，按照试剂说明书进行操作。HER2荧光原位杂交(FISH)检测步骤，将已脱蜡水洗的组织切片放入沸水煮20～30 min，再经37 ℃胃酶消化15 min，滴加0.05% 4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，5 min 后在荧光显微镜下观察消化进程，消化完毕后将切片放入柠檬酸钠缓冲液(SSC)5 min×2，甲醛固定液固定10 min，再放入SSC 5 min×2，梯度乙醇(70%、85%、100%)脱水，晾干。每张切片上滴加适量(5 μl)新鲜配制的HER2荧光标记探针，封片，放入杂交仪83 ℃变性6 min，42℃ 杂交孵育过夜。去封片胶，放入SSC×2泡掉盖玻片，放入70℃的0.4 SSC 2 min，放40℃的SSC 2 min×2，放入70%乙醇3 min，晾干。加DAPI 复染后，即可放在荧光显微镜下观察信号强度。

1.4结果判定 免疫组化结果由两位有经验的高年资病理医师采用双盲法独立阅片做出判断。HER2蛋白评分标准参照2007版乳腺癌HER2检测指南〔1〕：0：未见染色或<10%的间质中浸润性癌细胞呈现不完整的、微弱的胞膜染色；1+：>10%的浸润性癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色；2+：有两种情况，第一种为>10%的浸润癌细胞呈现不完整和(或)弱至中等强度的细胞膜染色，第二种为≤10%的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色；3+：>10%的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色。为方便临床可根据免疫组化结果来决定使用赫赛汀药物进行靶向治疗与否，根据中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2013版)，将HER2免疫组化结果为0及1+视为无HER2基因扩增(阴性)；3+视为有HER2基因扩增(阳性)；2+则应在进行FISH检测确认是否存在扩增。CD44v6结果判读〔2〕，阳性定位于细胞膜，用半定量的方法对切片免疫组织化学法的染色强度进行评分：无色为0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；再按阳性细胞所占百分比评分：阳性细胞<5%为0 分，5%～25%为1分，26%～50%为2 分，51%～75%为3分，>76%为4分。最终评分=染色程度×阳性细胞所占百分比评分：0分为阴性，<6分为弱阳性，≥6分为强阳性。

HER2荧光原位杂交结果判读：计数30个细胞大小较一致、胞核边界清晰完整、DAPI染色鲜艳均质、胞核分散、未有重叠、绿色着丝粒信号清晰可见的双色信号肿瘤细胞，计算Ration值(Ration值=30个所选肿瘤细胞胞核中红色信号总数与绿色信号总数的比值)。当Ration值>1.8认定为不存在基因扩增(阴性)；Ration值>2.2认定为存在基因扩增(阳性)；Ration值1.8～2.2之间时，则需重新计数，并计数细胞增至100个，或重新做FISH实验并按同样方法计数Ration值来判断最终结果。

1.5统计学方法 采用SPSS19.9软件进行χ2检验及Fish确切概率法，相关性采用 Spearman 等级相关分析。

2 结 果

2.1HER2和CD44v6蛋白在不同组织中的表达 115例UCB组织中，HER2蛋白表达61例(53.0%)，其中27例1+，9例2+，25例3+；30例慢性膀胱炎组织中HER2蛋白表达均为0；50例低度恶性潜能的乳头状尿路上皮肿瘤HER2蛋白表达18例(36.0%)，其中12例1+，5例2+，1例3+。对存在HER2免疫组化结果为2+的病例进行FISH检测，发现低度恶性潜能的乳头状尿路上皮肿瘤5例2+例病中FISH结果阳性2例，而UCB9例2+病例中FISH结果阳性5例。统计三组病例HER2的阳性率(即基因扩增率)，试验组膀胱尿路上皮癌为26.1%(30/115)，对照组慢性膀胱炎为0%，低度恶性潜能的乳头状尿路上皮肿瘤为6%(3/50)，各组间HER2阳性率有统计学意义(P<0.05)。

115例UCB患者中，CD44v6阳性63例(54.8%)，其中弱阳性17例，强阳性46例；30例慢性膀胱炎患者中CD44v6阳性2例(4.7%)，均为弱阳性；50例低度恶性潜能的乳头状尿路上皮肿瘤患者中CD44v6阳性13例(26.0%)，强阳性8例，弱阳性5例。各组间CD44v6阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2HER2和CD44v6阳性表达与UCB临床病理特征的关系 115例UCB不同性别、年龄组HER2阳性率差异无统计学意义(χ2=2.194，P=0.139，χ2=0.951，P=0.329)；不同肿瘤大小(χ2=9.982，P=0.002)、不同肿瘤级别(χ2=6.780，P=0.009)、不同肌层浸润(χ2=5.700，P=0.017)、是否复发病例(χ2=4.698，P=0.030)组间HER2阳性率差异均有统计学意义，见表1。115例UCB中CD44v6阳性率在不同性别(χ2=1.638，P=0.201>0.05)、不同年龄(χ2=1.087，P=0.297)、不同肿瘤大小(χ2=0.018，P=0.894)组间差异无统计学意义、不同肿瘤级别(χ2=9.502，P=0.002)、是否肌层浸润组间差异有统计学意义(χ2=7.401，P=0.007)；是否复发组间差异无统计学意义(χ2=0.211，P=0.646)。见表1。

表1 HER2、CD44v6阳性表达与UCB临床病理特征的相关性(n)

2.3相关性分析 在115例UCB组织中，HER2及CD44v6阳性者11例，二者同时阴性者33例，HER2阳性同时CD44v6阴性者19例，HER2阴性同时CD44v6阳性者52例，相关性分析结果提示，HER2 与 CD44v6 表达存在负相关(r=-0.216，P=0.02)。

3 讨 论

1987 年，Slamon 等〔3〕首先报道了HER2蛋白在人类乳腺癌的癌细胞中高强度表达。通常情况下，HER2多只在胎儿阶段表达，成年后鲜有表达。HER2是一种原癌基因，编码1型酪氨酸蛋白激酶(TPK)生长因子受体，是表皮生长因子受体(EGFR)家族的重要成员。该家族成员还包括HER1(EGFR)，HER3，HER4〔4，5〕。HER2基因位于17号染色体长臂第二区第一带(17q21)，编码产物为185×103 的一种跨膜糖蛋白，P185。但目前尚未发现可与 HER-2 配体结合区结合的特定配体，EGFR 家族的其他成员均发现有与其结合的特定配体〔4〕。

研究发现，HER2基因扩增的机制复杂，但主要是通过HER2和EGFR(HER1)二者之间的协同效应，间接地与配体结合，从而形成二聚体(同源或者异源)；通过直接使HER-2胞内羧基片段的酪氨酸残基发生磷酸化，激活HER2〔5〕。HER2的激活又磷酸化下游的信号转导蛋白，激活各种各类信号转导通路，从而引发级联的信号转导，影响肿瘤细胞的增殖、转化。其介导Ras/Raf/MEK/EPK，PI3K/AKT，PLC2γ/PKC，STAT 等信号通路，过程非常复杂。Ras/Raf/MEK/EPK 信号转导途径是在形成HER2磷酸化同源或异源二聚体后，HER2胞内羧基端的酪氨酸残基与下游的信号蛋白GRB2的SH-2区相结合，之后再与细胞膜内的鸟嘌呤核苷酸交换因子(SOS)作用，将 Ras-GDP磷酸化成 Ras-GTP，使得Ras蛋白得以激活，Ras蛋白诱导磷酸化Raf 激酶，最终使丝裂原活化蛋白激酶(MAPK，MEK)激活，MAPK被激活的信号随后传导至胞核内，磷酸化各类转录因子如 c-myc，c-fos 等，转转录活性得到加强，从而使机体对细胞的增殖、凋亡的调控机制失效〔6〕。PI3K/AKT 途径HER-2 蛋白磷酸化，PI3K得以激活，磷脂酰肌醇被诱导成为PIP2、PIP3(胞内的第二信使)，进而激活下游的蛋白激酶 Akt，活化后的Akt激酶作用于细胞内的NF-κB、凋亡抑制因子Bad、p21 基因、p53 基因等，使细胞不能正常生长及凋亡，进而使细胞的增殖和凋亡失去调控〔7〕。另外值得注意的，HER2异源二聚体减少了EGFR 与 cab-1 间的耦联，EGFR被细胞溶解酶水解的数量随之减少，造成EGFR细胞膜的表达数量增加，进而使得更多的信号通路得以激活〔8〕。HER-2 基因可通过激活血管内皮生长因子(VEGF)转录水平的启动子，使其在mRNA和蛋白表达水平得到提高，进而使更多的营养肿瘤的新生血管形成〔9〕。

膀胱癌中HER2蛋白的阳性表达率仅只低于乳腺癌及胃肠癌，是常见的具有HER2高表达的人类恶性肿瘤。源于实验室条件及所用抗体克隆号不同，各类研究结果出现较大差距，研究数据显示的HER2蛋白表达率从23%～80%不等，而基因扩增百分比范围在0～30%〔10～16〕。本研究结果，与文献基本相符，印证了膀胱癌中HER2的确存在过表达。通常异常激活HER2蛋白方式有两种：基因扩增或基因突变。基因扩增为大多数人熟悉，乳腺癌中HER2蛋白表达，多由基因扩增所致，甚至有人认识95%乳腺癌HER2过表达均有基因扩增引起〔17〕。而基因突变则是由于各种原因导致HER2蛋白的一些特点位置发生突变导致它异常激活。研究发现〔4〕位于HER2的原癌基因膜内区664位缬氨酸被谷氨酸取代，造成HER2癌基因形成。这种改变加强了分子间的氢键作用，使HER2因更容易形成二聚体而被激活。本研究发现膀胱癌中由非基因扩增导致蛋白过表达为36.8%，这部分很可能由基因突变所致。而Simonetti等〔18〕发现有一些HER2蛋白异常表达源于17号染色体出现了多倍体，而非基因扩增导致。

UCB患者可发生在任何年龄段，但多为中老年男性，也偶见儿童患者的报道，本研究显示UCB患者年龄及性别间差异对UCB组织中HER2阳性与否不存在直接关联。随着患者肿瘤的体积增大，HER2的阳性表达率随之提高〔19〕。本研究结果显示，UCB患者肿瘤最大径越大，其HER2阳性表达率则越高。同样胡文辉等〔20〕在检测一组73例膀胱癌的研究中，发现肿瘤直径>3 cm与直径≤3 cm之间HER2阳性表达率差异有统计学意义。可以看出，患者肿瘤的大小对HER2的表达有直接影响。本研究显示随着肿瘤级别不断升高，HER2阳性率也在不断升高。Coogan等〔13〕发现UCB中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的HER2蛋白表达率分别为14%、12%及48%。显而易见，HER2的阳性率受肿瘤的恶性程度影响。肿瘤浸润越深，HER2阳性率越高。本研究显示HER2阳性率在有无肌层浸润组间差异有统计学意义。Coogan等〔13〕发现Ta与T1期UCB中17%HER2蛋白阳性，而T2及T3的表达率为44%。更有报道〔21～24〕称浸润性尿路上皮癌中HER2强表达率为41%～81%。肿瘤中HER2表达同样影响其远期事件，HER2阳性患者术后复发率较阴性者明显升高。本研究中复发组与初发组HER2阳性率差异有统计学意义。Raica等〔25〕发现浅表的UCB(Ta、T1)随访36月，复发者其HER2阳性率为84.6%，而对应无复发者仅有7.1%。

HER2的表达是否会影响UCB患者的预后，本研究因存在资料不全，失访而未能统计，无法解释二者是否存在相关性。目前对于HER2表达对膀胱癌预后的是否有影响存在分歧。Coombs等〔26〕则认为，虽然HER2的过表达为膀胱癌提供了分子标志，但作为潜在的预后指标有待进一步研究。Masliukova 等〔27〕通过一系列的回顾性研究发现，HER2阳性UCB患者无瘤生存期明显低于阴性患者；以此同时，Kruger等〔22〕发现相对于HER2阴性患者，HER2过表达患者的疾病相关生存更短，因此他们认为HER2可以视为UCB的独立预后指标。本研究结果同样显示HER2蛋白阳性患者更易复发。目前，临床对膀胱癌患者的预后评估判断主要还是依据其肿瘤的临床病理分级、分期，HER2能否作为膀胱癌的独立预后指标，还有待于进一步研究发现。对乳腺癌的研究表明，曲妥珠单抗对伴有HER2 基因扩增的乳腺肿瘤的治疗取得了巨大成功举世关注，而且现在以HER2位靶点的药物也已开始应用于胃肠癌的临床治疗〔28，29〕。针对HER2基因的分子靶向治疗是否适用于膀胱癌，能给膀胱癌患者带来福音吗？邱学德等〔30〕人发现酪氨酸激酶抑制剂PD168393对HER2高表达的膀胱肿瘤细胞表现出较好的抗肿瘤活性。Kolla 等〔31〕指出赫赛汀、紫杉醇和顺铂等常用的辅助治疗药物，在对膀胱癌症患者和转移性病例的治疗上，它们之间具有有协同作用。可以看出，靶向药物在HER2阳性的膀胱癌治疗上有一定帮助，但还需待大宗实验数据来证实。

CD44，是一种广泛分布的单链表面蛋白〔32，33〕。人类的CD44基因位于11号染色体短臂上，全长50～60 kb，由20个外显子、19个内含子及选择性剪接插入的外显子构成〔34〕，外显子的长度在70～210 kb之间，外显子又分为组成型和变异性，分别各10个，他们之间由大小不等的内含子分隔。根据所含外显子的构成不同，分为标准型CD44(即CD44s)及变异型CD44(CD44v)。CD44s所含的10个外显子全部由组成型构成，所编码的蛋白包含361个氨基酸，理论分子量为90 kD。而CD44v则是在CD44s的基础系列中选择性剪接插入了其他外显子〔35〕，根据插入部位及外显子类型不同，分为10种异型(CDv1～CD44v10)〔36，37〕。其中，CD44v6是常见的一种CD44变异异型，与人类肿瘤密切相关，是在CD44s的胞外结构域插入变性拼接的V6外显子构成，所编码的跨膜糖蛋白含有43个氨基酸。

CD44分子，是机体一种常见黏附分子，分布于人体各种各类细胞的胞膜表面，介导细胞与细胞间、细胞与基质间的识别过程〔38〕。CD44分子作为淋巴细胞“归巢”受体参与淋巴细胞的激活及再循环，主要激活T细胞及NK细胞，并介导了淋巴细胞在体液中的运动。同样，也可参与细胞之间的各种信号传导，加快细胞有丝分裂，增强细胞表达各种因子及受体的能力，进而使机体细胞免于凋亡〔39，40〕。而CD44与相应的细胞骨架蛋白结合，则可促进伪足形成，对细胞形态及运动进行调控，加速其转移，促进肿瘤侵袭及进展〔41〕。另外，它也有调节机体对药物的吸收及机体对药物的敏感性、调节细胞通道、中和透明质酸及更新间质成分的作用。有学者认为某些CD44分子的高表达可促进恶性肿瘤的转移〔42，43〕。CD44v6作为CD44的一种特殊亚型，同样具有可以和透明质酸结合的膜外区，是其发挥生物功能的结构。CD44v6与肿瘤之间可能通过下面途径发挥作用：一方面，促进基质金属蛋白酶降结细胞外Ⅳ型胶原，使得肿瘤细胞不受基底膜的束缚，更易在间质中游走，提高了肿瘤细胞的侵袭力〔44〕；另一方面，促进黏着斑酶磷酸化，进而介导CD44内外的信号传导，激发其下游信号通路，使得PI3K/Akt信号通路和MAPK途径得以激活，进而加速肿瘤细胞分裂及增殖，抑制肿瘤细胞凋亡。此外，CD44v6可以通过模拟活化的淋巴细胞生物学特征，使得其可以具有与淋巴细胞类似的归巢运动，从而达到4“欺骗”人体的免疫系统，逃避免疫细胞及免疫因子识别和杀伤，让肿瘤细胞更易在淋巴结转移。

目前多数研究结果指出，UCB中存在CD44v6蛋白的过量表达，而在对应癌旁正常组织中表达量极低或不表达。王永辉等〔45〕应用免疫组化检查一组85例胃癌标本组织中CD44v6的表达率为43.5%，而癌旁膀胱组织为阳性率为17.1%，二者差距明显，同时，其的表达强度与肿瘤级别、肿瘤浸润深度及是否淋巴结转移关系密切。Afify等〔46〕在研究乳腺癌研究中，发现浸润性乳腺癌中CD44v6蛋白阳性表达率高达94%，而正常乳腺组织为阴性，淋巴结中转移的癌细胞100%表达。安慧敏〔47〕在研究一组72例结直肠癌标本的病例中发现，其CD44v6的阳性例数高达54例，且随临床病理分级呈正相关。综合以上研究结果，可明确得出结果，即CD44v6不仅在肿瘤组织存在高表达，而且或直接或间接参与了肿瘤的形成、浸润以及转移。

大量研究及实验结果提示〔48～51〕，UCB中存在CD44v6蛋白的过量表达，表达率大致在50%～90%之间，本研究实验CD44v6的阳性率为54.8%，以文献报道基本相符，略偏低，可能与试验选用的抗体相关，本研究选用的单克隆抗体，敏感性相对较弱，而特异性则较强，同样实验组病例组成对实验结果也存在一定影响。李沐寒等〔2〕在研究一组54例复发性膀胱尿路上皮中发现，CD44v6表达与性别与年龄无相关性，本实验显示了相同的结果。于胜强等〔52〕在研究71例UCB患者CD44v6的表达时，得出同样的结果。目前多数学者认为〔53～55〕，UCB中CD44v6的表达水平与其临床病理分级及分期呈负相关。Sugino等〔53〕认为在早期UCB中CD44基因高表达，而其丢失与肿瘤细胞获得侵袭性相关。Hong等〔54〕报道CD44v6 在病理分级越高，膀胱癌中表达越低，存在肌层浸润的膀胱肿瘤患者出现CD44v6过量表达时，预后相对较好。Lipponen等〔55〕进行一组173例膀胱移行细胞癌病例组成的回顾性研究，结果提示肿瘤的分级、分期与其肿瘤细胞中CD44V6蛋白的表达量呈负相关，而患者的生存率则与其表达强度呈正相关性。同时，也有一些学者〔49，56〕发现，随着UCB中CD44v6的阳性表达率升高，其临床病理分级分期随之升高。本文及相关研究结果支持CD44v6随着临床病理分级及分期的升高而降低，呈负相关。对于CD44v6对复发的影响，存在争议，有人认为〔49〕UCB中CD44v6表达水平越高，复发率越高。Matuschek等〔57〕同样认为CD44v6 mircoRNA表达过少与膀胱癌生存期延长相关。而李志强等〔51〕研究CD44v6的表达量与UCB患者有无复发、无瘤生存期及5年生存期三者之间不存在相关性，不能作为它的独立预后因子进行评估。本研究结果支持后者。

目前，对CD44v6与HER2相互关系的研究较少，多数在消化道癌，乳腺癌及脑肿瘤等，而罕有二者在膀胱癌中的相互作用的报告。Bao等〔58〕发现胃癌里CD44可直接与HER2结合，使得转移相关蛋白1表达增加，进而诱导组蛋白H3赖氨酸9形成，抑制microRNA-139的转运翻录，从而使趋化因子受体4的表达水平上调，进而使肿瘤细胞浸润及转移。王永辉等〔45〕在研究胃癌中CD44v6和HER2的表达时，发现二者同时表达组之外的其他比较组中二者均逐渐升高，经统计学分析有意义，而癌旁组织中却未见上述改变，提示在胃癌细胞的增殖方面，HER2和CD44V6二者相互起协调作用。Ghatak等〔59〕报道，CD44与透明质酸酶相互作用可以起到活化HER2的作用，这在对结肠癌及乳腺癌研究都得到证实。本研究结果提示HER2与CD44v6可能在UCB的发生、发展过程中共同起作用。