紫菜薹种子抗菌蛋白的分离纯化及其抑菌活性和稳定性研究

袁素素，秦武洒，张玮玮，王财成，叶秀娟

(福建农林大学,福建 福州 350002)

传统化学农药的长期使用，对地球环境和人体健康都造成了极大的危害，从天然产物中寻找新的抗菌药物成为解决这一难题的途径之一，近年来抗菌蛋白在农业上的潜在应用价值越来越被人们关注[1]。抗菌蛋白是生物体在长期进化过程中为了抵御病菌的侵害而产生的，目前，在很多植物、动物、真菌和细菌中都发现抗菌蛋白的存在[2-3]。Chan等[4]从褐色芸豆中分离出一种分子质量约为5.4 ku的抗菌蛋白，能够有效抑制落花生球腔菌的生长；Ye等[5]从红色甘蓝中纯化出一种分子质量约为30 ku的蛋白质，也对落花生球腔菌有抑制活性；Wang等[6]从地衣芽孢杆菌中分离出一种抗菌蛋白，其分子质量约为55 ku，能够抑制黄瓜霜霉病菌的生长，在叶片喷洒这种抗菌蛋白，能够有效抑制致病菌的侵染。抗真菌蛋白按其结构或功能可分为以下几类：几丁质酶、类几丁质酶蛋白、几丁质结合蛋白、类亲环素蛋白、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、防卫素、类防卫素、葡聚糖酶、凝集素、脂转移蛋白、过氧化物酶、蛋白酶抑制剂、核糖体失活蛋白等[7]。

紫菜薹(BrassicacampestrisL.var.purpureaBaileysh)是十字花科芸薹属植物，别名红菜薹、红油菜薹等。紫菜薹在蔬菜生产和消费中占有重要地位，在长江中下游流域和华南地区种植较多，是湖北省冬春季的主要特产蔬菜。紫菜薹茎和叶的色素中富含花色苷类物质，具有抗氧化、抗突变、抗癌、抗炎症及抗病毒等多种生物活性[8-10]，目前关于紫菜薹的研究主要集中在栽培、分子遗传以及生态学方面[11-13]，而对其种子中抗菌蛋白的研究报道较少。为此，以紫菜薹种子为研究对象，纯化抗菌蛋白并对其抑菌活性和稳定性进行初步研究，旨在纯化出抗菌效果较好的抗菌蛋白，进而开发为替代化学农药的一种抗菌药物，为解决传统农药在长期使用中产生的问题提供一种方法。

1 材料和方法

1.1 供试材料

茄病镰刀菌(Fusariumsolanif)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、烟草炭疽病菌(Colletotrichummicotianae)、芭乐炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、落花生球腔菌(Mycosphaerellaarachidicola)、苹果黑腐皮壳菌(Valsamali)、凸脐蠕孢菌(Exserohilummonoceras)和灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)共9种供试植物病原真菌，均由福建农林大学生物农药与生物化学教育部重点实验室提供。

紫菜薹种子购买于湖北省武汉市九头鸟种业有限责任公司。

1.2 紫菜薹种子抗菌蛋白的纯化

称取250 g干净的紫菜薹种子，用1 L 10 mmol/L NH4OAc缓冲溶液(pH值4.5)浸泡，置于4 ℃冰箱24 h，用豆浆机磨成匀浆，8 000 r/min离心20 min，取上清液依次按以下步骤纯化紫菜薹种子抗菌蛋白。

用10 mmol/L NH4OAc缓冲溶液(pH值4.5)平衡SP-Sepharose阳离子交换层析柱(5 cm×20 cm)，将上述上清液进行上样，上样结束后，继续用10 mmol/L NH4OAc缓冲溶液(pH值4.5)对未吸附的蛋白质进行洗涤，至280 nm吸光度值(OD280 nm)为0。然后分别用含有0.2、0.5、1.0 mol/L NaCl的10 mmol/L NH4OAc缓冲溶液(pH值4.5)洗脱，在280 nm下检测吸光度，同时依次进行吸收峰收集。以芭乐炭疽病菌为指示菌，运用纸片扩散法对各个洗脱组分进行抑菌活性检测，将具有活性的组分用蒸馏水透析，冷冻干燥得活性蛋白干粉。

用10 mmol/L NH4OAc缓冲液(pH值4.5)平衡Mono STM5/50GL强阳离子交换层析柱，流速为1 mL/min，将上一步的活性蛋白干粉溶解在相同的缓冲液中(质量浓度不超过50 mg/mL)，上样量为1 mL，上样结束后，继续用10 mmol/L NH4OAc缓冲液(pH值4.5)对未吸附的蛋白质进行洗涤，至OD280 nm为0。然后采用0～1 mol/L的盐梯度对吸附蛋白进行洗脱，同时进行吸收峰收集，以芭乐炭疽病菌为指示菌，运用纸片扩散法对各个峰收集组分进行抑菌活性检测，将具有活性的组分用蒸馏水透析，冷冻干燥得到活性蛋白干粉。

用20 mmol/L NH4HCO3缓冲液(pH值9.2)平衡SuperdexTM75 10/300GL层析柱，流速为0.5 mL/min，将上一步的活性蛋白干粉溶解在相同的缓冲液中(质量浓度不超过5 mg/mL)，上样量为100 μL，上样结束后，继续用20 mmol/L NH4HCO3缓冲液(pH值9.2)洗脱，同时对吸收峰进行收集。以芭乐炭疽病菌为指示菌，运用纸片扩散法对各个峰收集组分进行抑菌活性检测，将具有活性的组分用蒸馏水透析，冷冻干燥得到活性蛋白干粉样品，即为紫菜薹种子抗菌蛋白样品。

1.3 抗菌蛋白的抑菌活性检测

运用纸片扩散法[3]，将植物病原真菌预先接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，28 ℃恒温培养至菌落直径为3 cm时，将已经灭菌的滤纸片(直径6 mm)放置在距离菌落边缘0.5 cm处，用移液枪在滤纸片上加待测样品溶液15 μL，继续培养，直至出现半月形，观察并记录抑菌结果。

1.4 抗菌蛋白的SDS-PAGE分析

运用SDS-PAGE电泳进行分析，依次配制15%分离胶、4%浓缩胶，按预定的次序加入标准蛋白质(Marker)和紫菜薹种子抗菌蛋白样品，开始用30 V恒压电泳，待蛋白质条带进入分离胶时，增加电压至80 V，待蛋白质条带距离分离胶底部1 cm时关闭电源。取出电泳凝胶，进行考马斯亮蓝染色，2～3 h后用含10%冰乙酸(V/V)和10%甲醇(V/V)的脱色液进行脱色。

1.5 抗菌蛋白的稳定性检测

1.5.1 pH值稳定性 分别配制pH值为1、2、3、11、12、13的PBS缓冲液，同时用PBS缓冲液(pH值7.4)配制1 mg/mL的抗菌蛋白样品溶液。取6个离心管，在每个离心管中加入50 μL抗菌蛋白样品溶液，冷冻干燥后，分别向离心管中加入上述不同pH值的PBS缓冲液50 μL，静置30 min。以PBS缓冲液(pH值7.4)为阴性对照，以未处理的抗菌蛋白样品溶液为阳性对照(CK)，用芭乐炭疽病菌作为指示菌，通过纸片扩散法检测抗菌蛋白样品溶液的抑菌活性。

1.5.2 热稳定性 用PBS缓冲液(pH值7.4)配制1 mg/mL的抗菌蛋白样品溶液，取5个离心管各加入50 μL抗菌蛋白样品溶液，分别在40、50、60、70、80 ℃处理30 min后，用纸片扩散法，以芭乐炭疽病菌为指示菌检测抗菌蛋白样品溶液的抑菌活性。

1.5.3 金属阳离子稳定性 用无菌水配制浓度为100 mmol/L的Al3+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、K+、Cr3+溶液，用PBS缓冲液(pH值7.4)配制1 mg/mL的抗菌蛋白样品溶液。取50 μL抗菌蛋白样品溶液分装在11个离心管中，冷冻干燥后，分别向离心管中加入50 μL上述离子溶液和无菌水，其中加入无菌水为对照组(CK)，室温放置1 h，以芭乐炭疽病菌为指示菌，用纸片扩散法检测抗菌蛋白样品溶液的抑菌活性。

1.5.4 表面活性剂稳定性 用无菌水配制200 mmol/L的SDS溶液和2%(V/V)的吐温(Tween 80)溶液，用PBS缓冲液(pH值7.4)配制1 mg/mL的抗菌蛋白样品溶液。取3个1.5 mL的离心管，以体积比1∶1分别加入抗菌蛋白样品溶液和表面活性剂溶液(或无菌水)，其中加入无菌水为对照组(CK)，室温放置1 h，以芭乐炭疽病菌为指示菌，用纸片扩散法检测抗菌蛋白样品溶液的抑菌活性。

1.5.5 有机溶剂稳定性 分别配制20%(V/V)的甲醇、乙醇、丙醇、丙三醇、丙酮溶液，用PBS缓冲液(pH值7.4)配制1 mg/mL的抗菌蛋白样品溶液。取5个1.5 mL的离心管，以体积比1∶1分别加入上述有机溶剂和抗菌蛋白样品溶液，另取1个离心管，以体积比1∶1加入抗菌蛋白样品溶液和无菌水为对照(CK)，室温放置1 h，以芭乐炭疽病菌为指示菌，用纸片扩散法检测抗菌蛋白样品溶液的抑菌活性。

2 结果与分析

2.1 紫菜薹种子抗菌蛋白的纯化结果

将紫菜薹种子上清液上样于SP-Sepharose阳离子交换层析柱，对吸附蛋白进行盐梯度洗脱，得到SP1、SP2、SP3共3个吸收峰组分(图1A)，抑菌活性检测发现，SP2吸收峰组分对芭乐炭疽病菌具有抑制活性(图2)。

图1 紫菜薹种子抗菌蛋白的纯化结果

将SP2吸收峰组分上样于Mono STM5/50GL强阳离子交换柱，得到MS1和MS2共2个吸收峰组分(图1B)，抑菌活性检测发现，MS1吸收峰组分对芭乐炭疽病菌有抑菌活性(图2)。将MS1吸收峰组分上样于SuperdexTM75 10/300GL层析柱，得到SUP1、SUP2、SUP3共3个吸收峰组分(图1C)，抑菌活性检测发现，SUP2吸收峰组分对芭乐炭疽病菌具有抑制活性(图2)。对SUP2吸收峰组分进行SDS-PAGE电泳分析(图1D)，结果表明，从紫菜薹种子分离的抗菌蛋白为单一条带，分子质量约为13 ku，与十字花科植物山葵叶片中WjAMP-1抗菌蛋白的分子质量(15 ku)大小相近[14]。萝卜种子抗菌蛋白(9 ku)[15]和油菜种子campesin抗菌蛋白(9.4 ku)[16]比紫菜薹种子抗菌蛋白的分子质量稍小。Lin等[17]从菜薹中纯化出分子质量为5.7 ku的brassiparin抗菌蛋白，分子质量远小于紫菜薹种子抗菌蛋白，因而二者不是同一种抗菌蛋白。

图2 柱层析各吸收峰组分的抑菌活性测定结果

2.2 紫菜薹种子抗菌蛋白的抑菌活性测定结果

用纸片扩散法检测紫菜薹种子抗菌蛋白对植物病原真菌的抑制活性，结果显示，紫菜薹种子抗菌蛋白对茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌、烟草炭疽病菌、芭乐炭疽病菌、稻瘟病菌、落花生球腔菌、苹果黑腐皮壳菌、灰葡萄孢菌共8种植物病原真菌的生长具有抑制活性(图3)，而对凸脐蠕孢菌的生长没有抑制活性，说明紫菜薹种子抗菌蛋白的抗菌谱比较广。在十字花科其他植物中也纯化出具有广谱抗菌活性的抗菌蛋白，如萝卜种子Rs-AFP1和Rs-AFP2抗菌蛋白[18]、油菜种子campesin抗菌蛋白[16]和山葵叶片WjAMP-1抗菌蛋白[14]。

CK：PBS缓冲溶液；1：落花生球腔菌；2：苹果黑腐皮壳菌；3：稻瘟病菌；4：芭乐炭疽病菌；5：灰葡萄孢菌；6：尖孢镰刀菌；7：烟草炭疽病菌；8：茄病镰刀菌图3 紫菜薹种子抗菌蛋白的抑菌活性测定结果

2.3 紫菜薹种子抗菌蛋白的pH值稳定性与热稳定性

紫菜薹种子抗菌蛋白溶液经过不同pH值条件处理，用于检测抗菌蛋白的pH值稳定性，结果表明，其在pH值1～3和11～13条件下处理后，仍对芭乐炭疽病菌具有较强的抑制活性(图4A)，说明紫菜薹种子抗菌蛋白在强酸强碱环境下稳定性较好；紫菜薹种子抗菌蛋白样品溶液经过不同温度条件处理，用于检测抗菌蛋白的热稳定性，结果表明，其在40、50、60、70、80 ℃条件下处理后，对芭乐炭疽病菌仍然具有较强的抑制活性(图4B)，说明紫菜薹种子抗菌蛋白的热稳定性较好。已有其他研究发现，油菜抗菌蛋白和芥蓝种子抗菌蛋白也具有热稳定性和强酸强碱稳定性[16-17,19]。

图4 紫菜薹种子抗菌蛋白的pH值稳定性和热稳定性试验结果

2.4 紫菜薹种子抗菌蛋白的金属阳离子稳定性

紫菜薹种子抗菌蛋白经过不同金属阳离子处理后，用于检测抗菌蛋白的金属阳离子稳定性(表1)。抗菌蛋白在100 mmol/L的金属阳离子条件下，Al3+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+、Mg2+、K+、Cr3+8种金属离子对其抑菌活性没有明显影响，而Ca2+、Mn2+处理后，抗菌蛋白的抑菌活性消失，由此可知，紫菜薹种子抗菌蛋白经过大部分金属阳离子处理后，仍然对芭乐炭疽病菌具有抑制活性，因而紫菜薹种子抗菌蛋白的金属阳离子稳定性较好。萝卜种子抗菌蛋白Rs-AFP1和Rs-AFP2在50 mmol/L的K+条件下，抑菌活性也保持稳定[18]，而山葵叶片WjAMP-1抗菌蛋白在Ca2+、K+、Mg2+存在时，抑菌活性锐减[14]，由此可知，不同的抗菌蛋白对金属离子的耐受性不同。

表1 紫菜薹种子抗菌蛋白的金属阳离子稳定性试验结果

注：+为有抑菌活性，-为无抑菌活性，下同。

2.5 紫菜薹种子抗菌蛋白的表面活性剂稳定性

紫菜薹种子抗菌蛋白经过表面活性剂SDS(200 mmol/L)和吐温(2%)处理后，抑菌活性测定结果如图5所示，可知抗菌蛋白仍然对芭乐炭疽病菌具有抑制活性，说明表面活性剂对紫菜薹种子抗菌蛋白的抑菌活性没有影响。

图5 紫菜薹种子抗菌蛋白的表面活性剂稳定性试验结果

2.6 紫菜薹种子抗菌蛋白的有机溶剂稳定性

紫菜薹种子抗菌蛋白经甲醇、乙醇、丙醇、丙三醇、丙酮处理，用于检测抗菌蛋白对有机溶剂的稳定性，结果如表2，可以看出，紫菜薹种子抗菌蛋白对甲醇、乙醇、丙醇、丙三醇、丙酮5种有机溶剂稳定。

表2 紫菜薹种子抗菌蛋白的有机溶剂稳定性试验结果

3 结论与讨论

在十字花科植物中，已经发现多种抗菌蛋白的存在，如油菜[16,19-20]、山葵[14]、芥蓝[21]、萝卜[18]、大白菜[22]、拟南芥[23]、花菜[24]等中的抗菌蛋白，但对紫菜薹种子抗菌蛋白的研究还较少。本试验选取紫菜薹种子作为研究材料，匀浆后将其上清液依次通过SP-Sepharose阳离子交换层析柱、Mono STM5/50GL强阳离子交换层析柱和SuperdexTM75 10/300GL层析柱，分离得到一种天然的抗菌蛋白，采用SDS-PAGE分析发现，紫菜薹种子抗菌蛋白分子质量约为13 ku，属于小分子质量的抗菌蛋白，与山葵WjAMP-1抗菌蛋白分子质量(15 ku)相近[14]。然后对该抗菌蛋白的抑菌活性进行初步检测，发现其对8种植物病原真菌具有抑制活性，是一种广谱抗菌蛋白。

为研究紫菜薹种子抗菌蛋白的潜在应用价值，进而测定了该抗菌蛋白的pH值稳定性、热稳定性、金属阳离子稳定性、表面活性剂稳定性和有机溶剂稳定性。结果表明，紫菜薹种子抗菌蛋白能够耐强酸强碱和高温环境，除Mn2+、Ca2+以外的大多数金属离子不影响紫菜薹种子抗菌蛋白的抑菌活性。此外，表面活性剂和有机溶剂对紫菜薹种子抗菌蛋白的抑菌活性也都无影响。因而可知，紫菜薹种子抗菌蛋白是一种抑菌活性稳定、不易受环境影响、具有潜在应用价值的抗菌蛋白。

十字花科植物抗菌蛋白对病原真菌具有较强的抑制活性。其中，红色甘蓝抗菌蛋白分子质量约为30 ku，对落花生球腔菌的半抑制浓度(IC50)为5 μmol/L[5]；芥蓝种子抗菌蛋白分子质量为5.9 ku，对尖孢镰刀菌、玉米小斑病菌、落花生球腔菌、苹果树腐烂病菌的IC50分别为4.3、2.1、2.4、0.15 μmol/L[21]。结合本研究发现的抗菌蛋白的热稳定性、pH值稳定性、金属离子稳定性等生物学活性，可知十字花科植物抗菌蛋白具有开发为生物农药的潜在应用价值。为了更好地开发紫菜薹种子的应用价值，还需要对紫菜薹种子抗菌蛋白的抑菌效果和机制展开进一步研究。