血浆microRNA-21水平与左室射血分数保留的心力衰竭相关性肺高压的关系*

吴美华， 曾建斌， 熊向阳

(1江西省人民医院心内科， 2江西中医药大学附属医院, 3南昌大学基础医学院生化与分子生物学教研室, 江西 南昌 330006)

左心室射血分数保留的心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF)是指左室射血分数正常，但由于心肌肥厚和间质纤维化引起的室壁顺应性下降，使心室充盈受损，左心室舒张末压增高、肺循环淤血、心搏量减少而出现临床表现的一组综合征。HFpEF相关性肺动脉高压(pulmonary hypertension due to HFpEF，PH-HFpEF)是指由HFpEF引起的肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)，HFpEF患者出现PH与不良结局有关。微小RNA(microRNAs，miRNAs)为一种非编码小分子RNA，通过调控基因表达，参与许多细胞的生理病理过程[1]。miRNAs稳定存在于外周血[2-3]。在主动脉缩窄模型，心脏成纤维细胞高表达miR-21，升高的miR-21促进左室肥厚和纤维化，并抑制心脏成纤维细胞凋亡[4]。有研究发现，miR-21通过上调抗凋亡的Bcl-2基因表达，抑制心肌成纤维细胞凋亡，促进HFpEF的形成[5]。但miR-21是否与PH-HFpEF有关还不清楚。我们设想，miR-21调节心脏肥厚、纤维化和心力衰竭的机制可能同时与PH-HFpEF有关。白细胞介素6 (interleukin-6,IL-6)是一种多功能的细胞因子，有学者报道IL-6水平升高与PH有关[6]。 内皮素(endothelin，ET)是一种含21个氨基酸的多肽，具有强烈的血管收缩和促进平滑肌细胞增殖等作用。本研究主要检测血浆miR-21、IL-6和ET-1水平，分析其与PH-HFpEF的关系。

材 料 和 方 法

1 研究对象

选2014年1月～2017年2月，在江西省人民医院心内科就诊的HFpEF患者，HFpEF的纳入标准[7]：(1)有心力衰竭的症状和体征；(2)心脏(主要左心室)大小正常，且左室射血分数>45%；(3)存在心脏结构性改变(如左心房增大或左心室肥厚)和(或)心脏舒张功能障碍；(4)符合此类患者的人群流行病学特征，即大多为老年、女性、病因为高血压或有长期高血压病史，部分伴糖尿病或心房颤动等；(5)脑钠尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)和(或)N 末端脑钠尿肽原轻至中度升高，至少在灰色区域。对有三尖瓣反流的HFpEF患者，通过三尖瓣反流压差法估测肺动脉收缩压(pulmonary artery systolic pressure，PASP)。在无肺动脉狭窄时，右心室收缩压≈PASP=4v2+右心房压，右心房压根据下腔静脉超声特点确定，其中v是三尖瓣反流速度(m/s)。纳入的HFpEF患者按PASP分为PH-HFpEF组(n=36，PASP≥50 mmHg)和HFpEF组(n=40，PASP<50 mmHg)，排除1、3、4、5类PH。另选年龄、性别相应的同期健康体检者作为对照(health control)组(n=36)。获得知情同意书后，从肘静脉取血以检测miR-21等水平。

2 研究方法

2.1临床检测 采用Philips IE33型超声诊断仪，探头频率1～5 MHz。取左侧卧位，测量左心室舒张末内径、室间隔厚度和左心室后壁厚度、左房内径(left atrial diameter，LAD)，根据Devereux公式计算左心室重量(left ventricular mass，LVM)，左心室重量指数(left ventricular mass index，LVMI)=LVM/体表面积。通过化学发光微粒免疫分析法测定血浆BNP水平；双抗体夹心ELISA法测定 IL-6和ET-1水平。

2.2Real-time PCR检测血浆miR-21水平 血浆miRNA的提取用miRNeasy Mini Kit (Qiagen)，按照说明书提取总RNA。cDNA的合成用miScript II RT Kit (50) (Qiagen)。茎环逆转录引物和PCR引物购自RiboBio。miR-21茎环逆转录引物序列为5’-GTCG-TATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCATCGGATAC-GACTCAACA-3’；miR-21扩增上游引物为5’-GTTAGCTTATCAGACTGA-3’，下游引物为5’-GTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’；内参照cel-miR-39序列为5’-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’。miScript SYBR Green PCR Kit (200) (Qiagen)检测miRNA的表达。反应条件为： 95 ℃ 10 min； 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min, 40个循环。 PCR扩增用Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪。每个样本做3个复孔，获得Ct值，并在同一板上做无模板对照。用 2-ΔΔCt法计算miR-21的相对表达。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。正态分布的计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，组间均数比较采用单因素方差分析。计数资料以频数和百分率表示，组间比较应用卡方检验或Fisher确切概率法。偏态分布的计量资料以中位数(下四分位数，上四分位数)表示，组间比较采用Mann-Whitney检验。miR-21与临床资料(脑钠尿肽和LAD等)的相关性用Spearman相关分析。血浆miR-21预测PH-HFpEF的准确性用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析。多因素logistic回归分析与PH-HFpEF独立相关的危险因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组患者的临床特征

PH-HFpEF组患者年龄、血浆ET-1、血浆IL-6、脑钠尿肽和LAD均高于HFpEF组(P<0.05或P<0.01); PH-HFpEF组的LVMI与HFpEF组比较差异没有统计学显著性; 性别、BMI、高血压、糖尿病、冠心病和慢性肾病等的发生率各组之间的差异没有统计学显著性，见表1。

表1 PH-HFpEF组、HFpEF组及健康对照组临床特征

PET-1: plasma endothelin-1; IL-6: interlukin-6; LVMI: left ventricular mass index; LAD: left atrial dimension; AF: atrial fibrilation; DM: diabetes mellitus; CNP: chronic nephrosis; COPD: chronic obstructive pulmonary disease; CHD: coronary heart disease; BMI: body mass index; BNP: brain natriuretic peptide; Q1: the first quartile; Q3: the third quartile.*P<0.05,**P<0.01vsHFpEF group.

2 各组患者血浆miR-21的相对表达水平

除健康对照组有2例未能检出血浆miR-21外，其余各组均可检测到miR-21。PH-HFpEF组的血浆miR-21水平明显高于HFpEF组及健康对照组(分别P<0.05和P<0.01)，见图1。

3 血浆miR-21预测PH-HFpEF的ROC曲线

以血浆miR-21水平为检验变量，以HFpEF是否出现PH为状态变量作ROC曲线，结果显示，ROC曲线下面积为0.80(P=0.000), 其95%可信区间为 0.703～0.897, 切点值为1.83，敏感性和特异性分别为77.8%和32.5%，见图2。

4 血浆miR-21相对表达与血浆IL-6、ET-1、LAD、BNP、PH等的相关性

Spearman相关分析显示，血浆miR-21与PASP (r=0.267，P=0.000)、血浆IL-6 (r=0.302，P=0.013)和 LVMI(r=0.515，P=0.036)相关，而与ET-1 (r=0.872，P=0.070)、BNP (r=0.607，P=0.52)和LAD (r=0.395，P=0.23)等无相关性。而血浆IL-6与ET-1正相关 (r=0.622，P=0.002)。PASP与血浆IL-6 (r=0.36，P=0.023)、ET-1 (r=0.76，P=0.004)、BNP (r=0.43，P=0.031)及LAD (r=0.39,P=0.044)正相关。当以HFpEF患者有或无PH为因变量(HFpEF=1，PH-HFpEF=2)，以年龄、血浆miR-21相对表达、血浆IL-6、ET-1水平、LAD、BNP、BMI、LVMI等为自变量，进行多因素logistic回归分析显示，仅血浆miR-21相对表达水平、LAD和BNP与HFpEF患者出现PH正相关，是HFpEF患者肺高压的独立预测因素，见表2。

Figure 1.The relative expression of plasma miR-21. Mean±SD.*P<0.05,**P<0.01vshealthy control group;#P<0.05vsHFpEF group.

图1各组血浆miR-21相对表达比较

Figure 2.The area under the curve (AUC) analysis of receiver operating characteristic curve for diagnosis of PH in HFpEF patients.

图2血浆miR-21水平与HFpEF患者出现PH的ROC曲线

讨 论

PH是HFpEF的常见合并症，由于采用标准不同，研究报道HFpEF患者PH的发生率为50%～80%[8-9]。与1类的动脉性肺动脉高压不同，PH-HFpEF属于2类PH。在PH的发生早期可能只与被动增加的左房压(肺静脉压)有关。持续存在的肺静脉压升高导致肺静脉和肺小动脉内皮损害，功能紊乱，分泌血管活性介质失衡(缩血管物质分泌增加而舒血管的物质分泌减少)和肺血管结构改变，使肺动脉压进一步升高。本研究的PH-HFpEF组血浆ET-1浓度明显高于HFpEF组，也提示升高的ET-1可使肺血管收缩，导致肺动脉压升高。

表2 多因素logistic回归分析与HFpEF患者出现PH相关的因素

LAD: left atrial dimension; BNP: brain natriuretic peptide.

有研究表明，miR-21调节心肌成纤维细胞ERK-MAP激酶信号通路，对心脏的结构和功能产生影响。在衰竭心脏的心肌成纤维细胞，miR-21表达水平升高，miR-21通过增加分泌成纤维细胞生长因子2和抑制心肌成纤维细胞凋亡而促进心肌肥厚和纤维化，提示miR-21可能通过对心肌成纤维细胞的作用而成为HFpEF的重要调节器[4]。动物实验显示，拮抗miR-21表达可改善左室肥厚和纤维化[5]。本研究检测了HFpEF患者外周血miR-21，结果发现，与文献报道的主动脉瓣狭窄所致的左室肥厚及肥厚型心肌病患者血浆可检测到血miR-21升高相似[10]，HFpEF组血浆miR-21高于健康对照组，而且相关分析表明，血浆miR-21与LVMI相关。

miR-21是转化生长因子β/骨形态蛋白信号通路的直接靶点。在人类血管平滑肌细胞，转化生长因子β和骨形态蛋白都可通过增加细胞miR-21的水平来抑制程序性细胞死亡蛋白4，从而增加收缩性基因的表达[11]。来自计算机预测、细胞培养及动物模型的证据都表明，miR-21结合多种信号通路调控PH[12]。还有研究表明，miR-21 参与慢性缺氧引起的肺血管重构[13]。本研究显示，PH-HFpEF组血浆miR-21高于HFpEF组。Spearman相关分析发现，血浆miR-21与PASP正相关，也提示血浆miR-21升高与HFpEF患者肺高压有关。另外，血浆ET-1、IL-6、BNP、LAD等都分别与PASP相关。为排除混杂因素的干扰，当以HFpEF患者有或无PH为因变量(HFpEF=1，PH-HFpEF=2)，以年龄、miR-21相对表达、血浆IL-6、ET-1、LAD、BNP、BMI、LVMI等为自变量，进行多因素logistic回归分析显示，血浆miR-21相对表达水平仍与HFpEF患者出现PH独立相关。Wei等[14]研究也表明，与对照组比，经右心导管确诊的PH患者,循环miR-204、miR-21升高，并推测可能从受损的血管释放到循环，支持本研究结果。

一些研究证实，血管平滑肌、内皮和心脏成纤维细胞高表达miR-21，而心肌细胞是否表达miR-21，结果不一致[15-18]。Xu等[19]研究表明，心力衰竭患者竭力运动时，血浆miR-21表达增加。鉴于循环miRNA 表达的改变可能涉及不同机制，包括细胞释放或转录的变化。 推测当HFpEF患者病情加重，出现PH时，承受压力的肺血管可能释放更多miR-21入血，使PH-HFpEF组血浆miR-21表达增加。

IL-6 是一种多功能循环细胞因子，与机体炎症、宿主抵抗、组织损伤的免疫作用相关，由内皮细胞、平滑肌细胞及巨噬细胞产生和分泌。 Wang等[20]报道ET-l促使大鼠血管平滑肌细胞分泌 IL-6。有研究显示，在重度肺高压炎症模型，过表达人IL-6的转基因小鼠肺织 miR-21上调6倍[21]。而L｀ffler 等[22]研究表明，IL-6可诱导转录miR-21。本研究发现，PH-HFpEF组血浆IL-6水平明显升高，而且血浆miR-21与 IL-6相关,提示PH-HFpEF时升高的IL-6可能诱导肺组织miR-21转录增加，并释放到血液中导致血循环miR-21升高。

最近有研究提示，miRNA 可由不同器官的某种细胞类型产生，可像激素样被运输到效应器起作用[23]。因此推测PH-HFpEF时升高的IL-6也可能诱导心肌成纤维细胞释放miR-21增加，并被运送到肺血管在PH-HFpEF中起调节作用。

本研究进一步ROC曲线分析还发现，血浆miR-21诊断PH-HFpEF的ROC曲线下面积为0.80(0.703～0.897),提示血浆miR-21或可作为PH-HFpEF的生物标志物，用于预测PH-HFpEF。

本研究的缺陷是PH-HFpEF未经右心导管检查核实，而是通过超声估测。不过根据欧洲PH诊断指南，当超声估测的PASP>50 mmHg时，其准确度接近右心导管[24]。其次，血浆miR-21与远隔脏器表达的生物学关联还不明确，有待进一步研究。

总之，本研究表明，血浆miR-21与PH-HFpEF正相关，是PH-HFpEF的独立预测因素，可能是PH-HFpEF的生物标志物。但由于本研究是单中心、小样本的研究，结果应在多中心、大样本的研究中进一步验证。

致谢：本研究实施过程中得到医院信息科和病案室在资料收集方面的热心帮助，在此一并感谢。