β-雌二醇经ERβ-ERK1/2雌激素胞膜信号传导途径促进肺癌A549细胞迁移和侵袭*

董 年， 陈俊杰▲， 石 林， 陈成水△

(1温州医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科， 浙江 温州 325000; 2复旦大学附属中山医院呼吸内科， 上海 200000)

迁移和侵袭是肿瘤的恶性生物学行为之一[1]，也是肺癌病死率居高不下且远期预后不良的主要原因之一。肺癌迁移和侵袭的分子调控机制复杂，近年来逐渐认识到雌激素受体(estrogen receptor，ER)是潜在的调控靶点之一[2]。ER根据分子结构分为ERα和ERβ，根据功能途径可以划分为胞膜受体(membrane estrogen receptor，mER)和胞核受体(nuclear estrogen receptor，nER)， 其中mER介导新发现的胞膜启动的类固醇信号(membrane-initiated steroid signaling，MISS)传导途径，nER介导经典的胞核启动的类固醇信号(nuclear-initiated steroid signaling，NISS)传导途径[3]。目前针对肺癌细胞中ER亚型表达尚存争议，综合而言ERβ相较于ERα在肺癌中表达更为普遍[4]。一项针对肺癌组织免疫组化研究报道，胞质ERβ的表达与肿瘤侵袭、转移及不良预后密切相关[5]，同时有研究报道肺癌细胞中ERβ主要经MISS途径发挥作用[6]，但目前肺癌中ERβ是否经MISS途径调控肺癌细胞侵袭和转移尚未阐明。结合前期ERK1/2信号转导途径在调控肺癌侵袭和转移方面的研究[7]，本研究拟在阐明肺癌A549细胞中ER表达和胞内定位的基础上，探讨β-雌二醇(β-estradiol，E2)是否经ER调控雌激素胞膜信号传导途径，进而调控肺癌细胞迁移和侵袭，以深入揭示肺癌迁移和侵袭的分子机制。

材 料 和 方 法

1 实验细胞

乳腺癌MCF-7细胞和肺癌A549细胞购于上海中科院细胞库。

2 主要试剂

EMEM培养液、RPMI-1640培养液和胎牛血清购自Gibco；活性炭吸附胎牛血清和TRIzol购自Invitrogen；ERK1/2抑制剂PD98059和β-雌二醇购自Sigma；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、预染蛋白Marker和ECL 发光液购自Thermo；兔抗人ERα、p-ERK1/2和ERK1/2抗体购自CST；兔抗人ERβ和GAPDH抗体购自Santa Cruz； cDNA逆转录试剂盒购自TaKaRa；其它生化试剂购自上海生工生物工程公司。Real-time PCR引物由上海生工生物工程公司设计合成，序列见表1。

3 实验方法

3.1细胞培养 MCF-7细胞使用包含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和10 mg/L胰岛素的EMEM培养液， A549细胞使用包含10%胎牛和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养液，置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。使用0.25%胰酶溶液进行消化传代，获取生长状况良好的对数生长期细胞进行实验。进行雌激素信号通路和迁移功能相关实验时，将10%胎牛血清培养液改换5%活性炭吸附胎牛血清无酚红培养液。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

3.2Real-time PCR实验 获取生长状况良好的对数生长期的MCF-7细胞和A549细胞，按照TRIzol说明书提取细胞总RNA，分光光度法测定计算提取的总RNA含量及浓度。取总RNA 2 μg反转录为cDNA，再以适量cDNA为模板进行real-time PCR实验。反应条件为: 95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s、 60 ℃ 30 s，共40个循环。结果以GAPDH为内参照，所得数据以2-ΔΔCt法计算。

3.3Western blot实验 获取生长状况良好的对数生长期的MCF-7细胞和A549细胞，细胞裂解液裂解细胞，4 ℃、20 913×g离心10 min提取上清液，使用BCA测定蛋白浓度。2种细胞分别取30 μg蛋白行SDS-PAGE，湿转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温下封闭2 h， I抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min, II抗(1∶5 000)室温孵育1.5 h，再用TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min,ECL化学发光法显影。以GAPDH为内参照，结果以不同处理组蛋白与GAPDH灰度值比值表示。

获取生长状况良好的对数生长期的A549细胞，更换5%活性炭吸附胎牛血清无酚红RPMI-1640培养液培养24 h后，按照实验分组使用10 nmol/L β-estradiol分别刺激A549细胞10、20和30 min，Western blot实验方法如上所述，检测ERK1/2信号通路磷酸化情况。

3.4免疫荧光染色 获取生长状况良好的对数生长期的A549细胞，玻璃爬片事先置于24孔板，24孔板每孔接种5×104个细胞，待次日细胞贴壁后4%多聚甲醛固定15 min，0.1%GEPAL穿孔破膜10 min，1%BSA封闭1 h，I抗(1∶200)4 ℃孵育过夜，II抗(1∶200)室温孵育0.5 h，DAPI染核5 min，封片激光共聚焦显微镜观察。

3.5Transwell小室侵袭实验 获取生长状况良好的对数生长期的A549细胞，制备细胞悬液并调整细胞密度1×108/L，取200 μL细胞悬液接种Transwell上室(包被Matrigel)，24孔板下室添加600 μL 5%活性炭吸附胎牛血清RPMI-1640培养液，5%活性炭吸附胎牛血清RPMI-1640培养液中按照实验分组分别添加1、10 和100 nmol/L 3个浓度的β-estradiol，培养细胞24 h。取出Tranwell上室，弃去孔中培养液，PBS清洗1遍后使用4%多聚甲醛固定20 min，将小室适当风干，吉姆萨染色10 min，使用棉签擦拭小室上层未迁移的细胞，双蒸水洗净，400倍显微镜下随机5个视野观察细胞数量。

获取生长状况良好的对数生长期的A549细胞，制备细胞悬液并调整细胞密度1×108/L，取200 μL细胞悬液接种Transwell上室，24孔板下室添加600 μL 5%活性炭吸附胎牛血清RPMI-1640培养液，5%活性炭吸附胎牛血清RPMI-1640培养液中按照实验分组分别添加10、20、40 μmol/L 3个浓度的PD98059, 2 h后再添加10 nmol/L β-estradiol刺激24 h，Transwell小室侵袭实验方法如上所述，检测A549细胞的侵袭能力。

3.6细胞实时监测培养系统(Cell-IQ)监测细胞迁移能力 获取生长状况良好的对数生长期的A549细胞，制备细胞悬液调整细胞密度2×107/L，于24孔板每孔添加细胞悬液0.5 mL，培养24 h等待细胞贴壁后更换5%活性炭吸附胎牛血清无酚红RPMI-1640培养液培养，具体实验分组同Transwell小室侵袭实验实验分组，24孔板置入细胞实时检测培养系统，每个实验分组设置6～12个检测位点，每6 min系统拍摄照片一次。待置入细胞实时检测培养系统72 h后，分析软件计算统计细胞的迁移能力。细胞移动度的统计方法：在某一时点，所有的细胞相对于6 min前的记录图像中的移动距离总和。

4 统计学处理

使用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。数据均以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用Bonferroni校正的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 肺癌A549细胞中ER表达以ERβ为主

选取乳腺癌细胞MCF-7作为阳性对照，real-time PCR和Western-blot检测肺癌细胞A549中ERα和ERβ的表达，结果显示A549细胞以表达ERβ为主，见图1。

Figure 1.The dominant ERβ in lung cancer A549 cells. A: the mRNA expression of ERα and ERβ in breast cancer cells and lung cancer cells; B: the protein levels of ERα and ERβ in breast cancer cells and lung cancer cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsMCF-7.

图1肺癌A549细胞中ER表达以ERβ为主

2 肺癌A549细胞中以表达ERβ胞质亚型为主

Real-time PCR检测A549细胞中ERβ亚型的表达，结果显示以ERβ2 和ERβ5胞质亚型为主，见图2A。免疫荧光定位结果显示，ERβ在A549细胞胞质和胞核中皆有分布，但以胞质分布为主，图2B。

Figure 2.The dominant cytoplasmic ERβ in lung cancer A549 cells. A: the mRNA expression of ERβ1, ERβ2 and ERβ5 in lung cancer cells; B: the immunofluorescence of ERβ location in lung cancer cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsERβ1.

图2肺癌A549细胞中以表达ERβ胞质亚型为主

3 β-Estradiol引起ERK1/2磷酸化水平增加并促进A549细胞的迁移和侵袭

使用β-estradiol刺激A549细胞不同时间， Western blot法结果显示,与空白组相比,β-estradiol可以增加ERK1/2蛋白的磷酸化水平，以30 min时点最为明显(P<0.05)，见图3A。Transwell小室侵袭实验和活细胞检测培养系统结果显示,与空白组相比，β-estradiol在可以促进A549细胞的迁移和侵袭能力，以100 nmol/L浓度最为明显，呈现浓度依赖性增加(P<0.05)，见图3B、C。

Figure 3.β-Estradiol (E2) induced phosphorylation of ERK1/2 and promoted the invasion and migration of lung cancer A549 cells. A: the protein levels of p-ERK1/2 and ERK1/2 in A549 cells treated with E2(10 nmol/L) for the indicated time were detected by Western blot; B: the invasion capacity of A549 cells treated with E2at the indicated doses was detected by Transwell assay; C: the migration capacity of A549 cells treated with E2at the indicated doses was detected by Cell-IQ assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图3β-estradiol引起ERK1/2磷酸化水平增加并促进A549肺癌细胞的迁移和侵袭能力

4 抑制ERK1/2信号传导可以逆转β-estradiol促进的肺癌A549细胞侵袭和迁移

使用ERK1/2抑制剂PD98059与β-estradiol共同处理A549细胞，Transwell小室侵袭实验和活细胞检测培养系统结果显示, ERK1/2抑制剂PD98059可以逆转β-estradiol促进的细胞侵袭和迁移能力提高，以40 μmol/L PD98059最为明显(P<0.05)，见图4。

讨 论

肿瘤迁移和侵袭主要包括可逆的细胞骨架重整和持久的上皮-间充质转化，涉及快速活化的胞膜信号传导和持久调控的胞核信号传导途径的双重调控[8-9]，寻找膜核信号传导中的关键信号节点可以深入揭示肺癌侵袭和转移的分子机制。Marquez-Garban等[10]研究报道ER与肺癌临床预后密切相关，其中肿瘤组织免疫组化mER阳性表达预示着更高的临床分期，提示mER可能参与肿瘤的迁徙侵袭过程。与nER介导的NISS传导途径调控存在经典的雌激素反应元件(estrogen response element，ERE)基因的转录和翻译不同，mER介导的MISS传导途径调控c-Src和Ras等蛋白激酶的活化[11]。目前mER介导的MISS在肿瘤、增殖、凋亡、侵袭和转移中的作用是目前研究热点[12]。与乳腺癌中ERα主导角色不同的是，目前肺癌中ER亚型的表达尚存争议，一方面是没有使用统一的ER抗体和免疫组化读片阳性标准，另一方面是ER亚型存在不同的剪切异构体，ERα包括ERα66、ERα46和ERα36[13]，ERβ存在ERβ1、ERβ2、ERβ4和ERβ5[14]。因此，本研究首先选择了乳腺癌MCF-7细胞作为阳性对照，以肺癌A549细胞作为研究对象，检测出A549细胞以表达ERβ为主。Wang等[15]报道，肺癌中ERβ以表达ERβ1(胞膜分布和胞核分布)、ERβ2(以胞膜分布为主)和ERβ5(以胞膜分布为主)为主。由于目前缺乏特异性ERβ1、ERβ2和ERβ5抗体，本研究设计合成不同ERβ剪切异构体引物，采用real-time PCR检测显示A549细胞以ERβ2和ERβ5表达为主，荧光定位进一步揭示肺癌细胞中ERβ以胞膜分布为主，意味着MISS途径是A549细胞中ERβ发挥功能的主要途径。以上研究在细胞水平深入阐明了ERβ是A549细胞中主要ER，并且mERβ主要经MISS途径发挥作用而调控细胞生物学行为。

Figure 4.Inhibition of ERK1/2 reversed β-estradiol (E2)-promoted invasion (A) and migration (B) of lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsE2group.

图4抑制ERK1/2信号传导可以逆转β-estradiol促进的肺癌A549细胞侵袭和迁移

既往对ER在肺癌迁移和侵袭方面的研究主要围绕ER的NISS途径，包括上皮-间充质转化和骨桥蛋白的分泌等[16-17]，以上NISS途径涉及胞内蛋白的转录和翻译，需要较长时间。本研究选择β-estradiol刺激A549细胞24 h后，通常尚未发生NISS途径介导蛋白水平明显变化，检测到细胞迁移和侵袭能力的提高，因此推测mERβ经MISS传导途径调控细胞骨架重整，获得了侵袭表型。结合我们之前已经在ERK1/2信号转导调控肺癌侵袭和转移方面开展的相关系列研究基础[7,18]，我们推测ERK1/2信号传导参与mERβ介导的MISS传导途径，从而调控A549细胞的迁移和侵袭。本研究结果检测出β-estradiol可以经mERβ快速激活ERK1/2信号转导，抑制ERK1/2信号转导可以逆转β-estradiol促进细胞迁移和侵袭。以上揭示了mERβ通过调控ERK1/2信号转导促进A549细胞侵袭和转移，与Verma等[19]和Hershberger等[20]研究报道mERβ经ERK1/2信号转导促进肺癌细胞增殖结果相似。以上研究结果揭示了β-雌二醇经ERβ-ERK1/2雌激素胞膜信号传导途径促进肺癌A549细胞迁移和侵袭，ERK1/2是ERβ雌激素胞膜信号转导中与肺癌侵袭和转移相关的重要信号节点。然而研究尚存着较多的不足之处。首先，目前ERβ拮抗剂主要针对NISS途径，在后续实验中尚需使用siRNA 敲低ERβ表达，深入验证ERβ通过调控MISS促进肺癌细胞侵袭和转移；其次，本研究仅仅选取了A549一个细胞系，考虑到实验的可靠性，以后势必要在多种肺癌细胞系中进行验证。

综上所述，本研究初步阐明了ERβ在肺癌A549细胞中的表达和胞膜分布，显示了ERK1/2是ERβ调控雌激素胞膜信号转导并参与肺癌侵袭和转移的关键信号传导节点，进一步深入揭示了肺癌侵袭和转移的分子机制。