黄芩苷对冠心病大鼠缺血再灌注损伤的治疗作用及机制

黄浪，徐策，许光宇

(1海南省人民医院，海口570311；2川北医学院；3开封大学)

研究显示，内质网应激与心脏发育或心脏相关疾病的发生发展密切相关[1]。当发生内质网应激时，细胞内细胞器包括内质网到细胞核中的多种相互关联的信号传导通路被连续激活，该现象即为未折叠蛋白反应(UPR)。其中分子伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)及3个感受器蛋白肌醇酶1(IRE1)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)及活化转录因子6(ATF6)共同构成并参与了UPR的整个过程，以上指标也反映了机体内质网应激状态[2，3]。因此，寻找有效抑制内质网应激反应的药物，对于冠心病的治疗具有重要意义[4]。黄芩苷是从中药黄芩根茎中分离纯化的黄酮类单体化合物，其具有抗氧化和抗细胞凋亡等多种生物学功能，在改善心肌缺血及提高心肌功能方面有一定作用[5]。本研究于2017年1～12月探讨黄芩苷对冠心病大鼠缺血再灌注损伤的治疗作用及机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 雄性SD大鼠25只，体质量(200±50)g，1月龄，由川北医学院实验动物中心提供。黄芩苷(固体粉剂，纯度99.8%，批号2015034，西安昊轩生物科技公司)，小动物麻醉机(E-Z美国Systems公司)，兔抗人GRP78、IREI、PERK和ATF6单抗(CST公司)，qRT-PCR检测试剂盒(Takara公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(武汉博士德公司)，TRIzol试剂(Invitrogen公司)，蛋白提取试剂盒、ECL增强化学发光试剂盒和BCA蛋白定量检测试剂盒(Thermo公司)，RNA抽提试剂盒(Applied Biosystems公司)，TaqMan逆转录试剂盒(Life Technologies公司)，qSYBR-Green-containing PCR试剂盒(Qiagen公司)，奥林巴斯荧光倒置显微镜Olympus IX7(Olympus，UIS2光学成像系统，Image-Pro Plus7.0成像系统)，Multiskan MK3酶标仪(Thermo公司，型号413MBY042078)，TUNEL凋亡检测试剂盒(德国罗氏公司)，IQTM5 Multicolor实时荧光定量系统(美国BioRad公司)。

1.2 冠心病模型构建 大鼠适应性喂养1周，将其随机均分为对照组、模型组、10 mg/kg黄芩苷组、25 mg/kg黄芩苷组和50 mg/kg黄芩苷组，各5只。建立冠心病大鼠模型，方法：冠心病与黄芩苷组先给予维生素D 70万U/kg连续灌胃5 d后给予高脂饲料饲养，每100 g饲料中含胆固醇3 g、白糖5 g、猪油20 g、维生素D 1 g、蛋黄粉2 g、丙基硫氧嘧啶0.2 g、基础饲料69 g，饲养16 周。对照组先给予等体积生理盐水灌胃5 d后给予普通饲料饲养，每100 g饲料中含米糠9 g、玉米粉50 g、骨粉3 g、黄豆粉30 g、维生素1.3 g、矿物质6.7 g，饲养16周。腹腔内注射25%乌拉坦3 mL/kg麻醉，30 min后腹腔内注射垂体后叶素30 U/kg，当心电图显示Ⅱ导联T波低平或倒置，ST段下移，表明冠心病大鼠造模成功。模型组与黄芩苷干预组大鼠均造模成功。

1.3 药物干预及心肌缺血模型构建 成功建模后，10、25、50 mg/kg黄芩苷组分别给予10、25、50 mg/kg黄芩苷灌胃，模型组、对照组给予等量蒸馏水灌胃，均1次/d，连续2周，期间各组均常规喂养。灌胃结束前晚8点撤走食槽，各组均禁饮食12 h，腹腔内注射25%乌拉坦3 mL/kg麻醉，30 min后除对照组外其余各组均腹腔内注射垂体后叶素30 U/kg建立冠心病心肌缺血模型，对照组腹腔注射等体积生理盐水。

1.4 大鼠心功能检测 各组背部固定，记录大鼠心功能相关指标。将针灸针刺入大鼠四肢皮下，导联线一端接于生物信号采集器，一端黑色、红色、黄色夹子夹在针灸针上，大鼠安静时记录心电图，持续时间1 min。观测并记录各组大鼠缺血30 min的心电图T波变化，然后经右侧颈总动脉插管到大鼠的左心室，连接压力传感器和生物信号处理系统，记录左室舒张压、收缩压、最大收缩期内的压力变化速率(+dp/dtmax)、最大舒张末期的压力变化速率(-dp/dtmax)。人工呼吸下开胸结扎冠状动脉左旋支7 min，随后再灌注120 min时T波变化，观测并记录各组大鼠的心电图，同时监测左室舒张压、收缩压、+dp/dtmax、-dp/dtmax。

1.5 大鼠心肌梗死面积百分比测算 采用硝基四氮唑蓝染色法。处死大鼠后获取心肌组织，清洁之后的心脏于-20 ℃冷冻1 h后，将其切成2 mm切片，放在1%的TTC磷酸缓冲液内，室温下避光孵育20 min后停止染色，将切片置于10%甲醛溶液中固定，第2天可观察到非梗死区为深红色着色，梗死区为灰白色着色，经数码相机拍照采集数据，再经病理图像分析系统采集并计算左心室梗死区的实际面积百分比。

1.6 大鼠心肌细胞凋亡率测算 用缺口末端标记法。在显微镜下可观察到凋亡细胞核为棕褐色着色，图像采集时每张切片均需随机选择并记录至少5个高倍镜下的视野，统计其中总细胞核数量大于200的数据，计算细胞的凋亡数量和总数量的比值。

1.7 大鼠心肌组织中GRP78、IREI、PERK和ATF6蛋白表达检测 采用Western blotting法。提取大鼠心脏组织200 mg，将其磨碎后加进预冷蛋白质的抽提试剂，将其放置0.5 h后给予14 000 r/min离心15 min，再提取上清液实施蛋白检测。电泳后取1 μg的蛋白给予变性冷却，依次加样和电泳以及转膜，再添加封闭液，在室温下封闭1 h，添加稀释1∶1 000的兔抗人GRP78、IREI、PERK、ATF6和GAPDH一抗(CAT，美国)进行孵育，4 ℃摇床过夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入1∶100 000的羊抗兔二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入ECL发光剂并用X线片曝光、显影、定影、扫描并保存条带图片。以Quantity One软件分析，以目的蛋白条带的灰度值与内参GAPDH蛋白灰度值比值作为目的蛋白的相对表达量。每组设置3个复孔。

1.8 大鼠血清中GRP78、IREI、PERK、ATF6 mRNA检测 采用qRT-PCR法。心肌缺血模型构建成功次日清晨用吸入式异氟烷麻醉大鼠，用1 mL注射器经大鼠上腔静脉取血，在3 000 r/min下离心10 min，取上层血清，置于-80 ℃冰箱内保存待检。TRIzol法提取血清中的mRNA，根据逆转录聚酶链反应试剂盒的说明书进行操作。GRP78、IREI、PERK和ATF6的引物由Invitrogen公司合成，GAPDH为内参,反应体系为20 μL。用2-ΔΔCT法计算GRP78、IREI、PERK、ATF6 mRNA的相对表达量。每个样本设置3个复孔。

2 结果

2.1 各组心功能指标比较 与对照组比较，模型组缺血30 min波形变化、缺血再灌注120 min T波变化和左室舒张压高(P均<0.05)，左室收缩压、+dp/dtmax和-dp/dtmax均低(P均<0.05)；与模型组比较，10、25、50 mg/kg黄芩苷组缺血30 min波形变化、缺血再灌注120 min T波变化和左室舒张压低(P均<0.05)，左室收缩压、+dp/dtmax和-dp/dtmax均高(P均<0.05)，且具有剂量依赖性(P均<0.05)。见表1。

表1 各组心功能指标比较

2.2 各组心肌梗死面积百分比、心肌细胞凋亡率比较 与对照组比较，模型组心肌梗死面积百分比、心肌细胞凋亡率高(P均<0.05)；与模型组比较，10、25、50 mg/kg黄芩苷组心肌梗死面积百分比、细胞凋亡率均低(P均<0.05)，且具有剂量依赖性(P均<0.05)。见表2。

表2 各组心肌梗死面积百分比、心肌细胞凋亡率比较

2.3 各组心肌组织中GRP78、IRE1、PERK、ATF6蛋白表达比较 与对照组比较，模型组心肌组织中GRP78、IRE1、PERK和ATF6蛋白相对表达量高(P均<0.05)；与模型组比较，10、25、50 mg/kg黄芩苷组心肌组织中GRP78、IRE1、PERK和ATF6蛋白相对表达量低(P均<0.05)，且具有剂量依赖性(P均<0.05)。见表3。

表3 各组心肌组织中GRP78、IRE1、PERK、ATF6蛋白表达比较

2.4 各组血清中GRP78、IREI、PERK、ATF6 mRNA表达比较 与对照组比较，模型组血清中GRP78、IRE1、PERK、ATF6 mRNA相对表达量高(P均<0.05)；与模型组比较，10、25、50 mg/kg黄芩苷组血清中GRP78、IRE1、PERK、ATF6 mRNA相对表达量低(P均<0.05)，且具有剂量依赖性(P均<0.05)。见表4。

表4 各组血清中GRP78、IREI、PERK、ATF6 mRNA表达比较

3 讨论

黄芩苷是从中药黄芩的根茎中分离纯化得到的一种黄酮类单体化合物，黄芩苷具有多种生物活性和功效，如抗氧化、抗凋亡和抗过敏作用、增强机体免疫力的作用、抑菌作用等[6,7]。除此之外，研究显示，黄芩苷可在多种心血管疾病中发挥良好的治疗作用，如黄芩苷对铁超载小鼠的肝、肾和心脏组织的氧化损伤均有不同程度的改善作用[8]；黄芩苷可降低严重急性胰腺炎大鼠的炎症指标、减少心肌细胞的凋亡，对损伤大鼠的心脏有保护作用[9]。但其具体作用机制目前尚不明确，特别是关于黄芩苷在内质网应激中的调节作用，迄今为止国内文献尚无相关报道。

各种损伤性因素均可激活机体组织和细胞内的内质网应激机制，从而导致动脉粥样硬化、缺血性心脏病(冠心病)、缺血再灌注心肌损伤和心肌肥大等多种心脏类疾病的发生和发展[3]。内质网是多种蛋白质及糖和脂合成的细胞器，其内环境稳态易受各种理化因素的影响，从而直接影响蛋白质的合成和表达，影响细胞的生存状态。若细胞发生UPR，内质网内环境稳态被打破，进一步诱导内质网应激反应，导致细胞凋亡，最终直接导致细胞死亡。另外内质网还可通过介导多种信号通路直接影响分子伴侣蛋白GRP78及其3个感受器蛋白IRE1、PERK和ATF6的表达，使其表达上调，从而诱导细胞凋亡[10～12]。

本研究结果显示，模型组大鼠心肌组织和血清中GRP78、IRE1、PERK和ATF6蛋白表达均高于对照组，心肌梗死面积百分比和细胞凋亡率高于对照组。说明模型构建成功。冠心病心肌缺血再灌注损伤是影响冠心病患者预后的一个重要因素。再灌注过程中会产生大量氧自由基，使心肌细胞内钙超载，直接造成心脏再灌注损伤[13]。研究显示，心肌缺血再灌注过程中内质网发生应激反应，更进一步促进冠心病的进展；内质网内环境稳态被打乱，激活其关联的生存或凋亡相关通路，使内质网应激相关因子的表达上调，心肌细胞凋亡增加，进一步加重心肌缺血再灌注损伤[14]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组缺血30 min的波形变化、缺血再灌注120 min T波变化和左室舒张压均增加，大鼠左室收缩压、+dp/dtmax和-dp/dtmax均降低；而不同剂量的黄芩苷可逆转上述指标的变化趋势，且黄芩苷的逆转能力呈剂量依赖性。这提示黄芩苷针对冠心病大鼠的缺血再灌注损伤具有较好的治疗作用。另外不同剂量的黄芩苷使模型组大鼠的心肌组织和血清中GRP78、IRE1、PERK和ATF6蛋白表达下调，可见黄芩苷可抑制冠心病大鼠中内质网应激相关因子的表达；且该作用呈剂量依赖性，当黄芩苷剂量为10～50 mg/kg时，浓度越高，抑制内质网应激相关因子表达的作用就越强。上述结果与已有研究[15]类似。

综上所述，黄芩苷可减少冠心病大鼠心肌梗死面积，降低心肌细胞凋亡率。原因可能为黄芩苷可调节GRP78、IRE1、PERK和ATF6蛋白表达，进而改善了大鼠冠心病症状，并对心肌细胞及心脏功能有一定的保护作用。