烧伤复合海水浸泡大鼠的多器官损伤分析

李丹丹，马伟，胡明，冯友新，瞿秀华，张达矜，乔媛媛

(中国人民解放军海军总医院，北京100048)

随着我国海洋经济的发展，海洋事业活动日益频繁，加之海军执行任务半径增大，海上事故时有发生，受伤合并烧伤发生率较高。海水具有特殊的物化性质，如高渗、碱性、低温、有菌等，若伤员坠海则伤口被海水浸泡[1]。烧伤合并海水浸泡会造成伤员电解质紊乱、高渗性脱水、酸碱失衡、感染及多脏器功能衰竭，甚至死亡[2]。严重烧伤后人体将发生不同程度的低血容量休克，引起主要器官缺血、缺氧损害，尤其肠道损伤，导致烧伤后全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征(MODS)[3]。2017年10月～2018年2月，本研究以烫伤合并海水浸泡大鼠为模型，观察烫伤合并海水浸泡后的伤情特点，为研究烧伤合并海水浸泡救治提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 雄性SD大鼠120只，体质量(290.3±7.5)g，由军事医学科学院动物研究所提供，昼夜节律饲养，自由饮食，实验室内适应饲养1周。B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)一抗兔多克隆抗体(北京碧云天公司)，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)一抗兔多克隆抗体(美国Abcam公司)，PV-9000二步法免疫组化检测试剂、DAB显色试剂盒、SAP-9100试剂盒(中杉金桥公司)，其他试剂均为国产分析纯或优级纯。全自动生化分析仪(日立)。

1.2 人工海水配制 根据国家海洋局第三研究所配方配制。渗透压(1 250±11)mmol/L，pH 8.2，钠离子(630±5)mmol/L，钾离子(10.88±0.68)mmol/L，氯离子(658.8±5.5)mmol/L，温度(22±1)℃，水温20～22 ℃。

1.3 动物分组及处理 将大鼠随机分为正常对照组、单纯烧伤组及烧伤浸泡2、6、12、24 h组(n=20)。正常对照组不作处理；单纯烧伤组、烧伤浸泡组用1.5%苯巴比妥钠腹腔注射麻醉，背部30%区域脱毛，按文献[4]方法电烙铁烧5 s，致背部30%总体表面积深Ⅱ度烫伤。烧伤浸泡组致伤后将大鼠置于固定架，浸泡于人工海水中，浸泡平面超过伤口创面，分别浸泡2、6、12、24 h。最终正常对照组、单纯烧伤组及烧伤浸泡2、6、12、24 h组分别存活20、20、17、13、14、8只。各组分别取8只大鼠，麻醉后采集其下腔静脉血，将其处死取肝、肺及肠道组织，于距回盲部5 cm处取小肠组织(长度2 cm)。

1.4 血液指标检测 肝功能指标：谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、总胆汁酸(TBA)；肾功能指标：尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、血尿酸(UA)、乳酸脱氢酶(LDH)；应激指标：超敏C反应蛋白(hs-CRP)、血糖；组织代谢及缺氧指标：乳酸(LAC)、乙酰丙酮(ACAC)、血红蛋白(Hb)；血离子：钾、钠、氯、钙、磷、镁等离子。

1.5 肝、肺、肠组织病理学变化观察 取各组肝、肺、肠组织在等渗盐水中清洗后，于10%中性多聚甲醛溶液中固定24 h，行常规石蜡包埋、切片(厚度5 μm)，经苏木精-伊红染色，于光镜下观察各组织病理变化。

1.6 肝、肺、肠组织中凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2表达检测 采用免疫组化法。取组织切片，置65 ℃恒温箱烘烤60 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液各浸泡15 min；各浓度乙醇梯度水化，1×PBS缓冲液洗切片5 min×3次，滴加3%过氧化氢，室温放置30 min去除内源性过氧化物；1×PBS缓冲液洗切片5 min×3次；柠檬酸盐溶液中煮沸进行抗原热修复；1×PBS缓冲液洗切片5 min×3次；滴加10%胎牛血清，37 ℃孵育60 min封闭非特异性结合位点，用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加一抗Bcl-2(稀释比例1∶100)，Caspase-3(稀释比例1∶100)，放入湿盒后置于4 ℃冰箱孵育过夜；隔日将切片复苏1 h，回收一抗，1×PBS缓冲液洗切片5 min×3次；滴加二抗，37 ℃孵育30 min；滴加二抗，37 ℃孵育30 min；1×PBS缓冲液洗切片5 min×3次；显微镜下滴加DAB 工作液(稀释比例1∶200)显色，出现深棕色后，自来水充分冲洗终止显色反应；苏木素复染细胞核；各浓度乙醇梯度脱水，中性树胶封片置于镜下观察。Caspase-3及Bcl-2阳性染色为棕黄色，定位于细胞质，以细胞呈清晰棕色或棕褐色为阳性。用PBS代替一抗做阴性对照。计算各组蛋白阳性表达率[5]。

2 结果

2.1 各组肝功能指标比较 与正常对照组比较，单纯烧伤组、烧伤浸泡组AST、ALT水平高(P均<0.05)；烧伤浸泡2、6、12、24 h组AST、ALT水平逐渐升高(P均<0.05)，且烧伤浸泡6、12、24 h组AST、ALT水平均高于单纯烧伤组(P均<0.05)。各组肝功能其他指标比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

2.2 各组肾功能指标比较 与正常对照组比较，单纯烧伤组、烧伤浸泡组BUN、LDH水平高(P均<0.05)；与单纯烧伤组比较，烧伤浸泡24 h组AST、 ALT水平高(P均<0.05)。各组其他肝功能指标比较差异无统计学意义(P均>0.05)。与正常对照组比较，烧伤浸泡2 h组SCr低(P<0.05)。烧伤浸泡组UA虽升高，但与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 各组肝功能指标比较

表2 各组肾功能指标比较

2.3 各组应激及组织代谢、缺氧指标比较 烧伤浸泡组hs-CRP水平逐渐升高，烧伤浸泡12、24 h组hs-CRP水平较正常对照组和单纯烧伤组高(P均<0.05)；烧伤浸泡2、6、12 h组血糖先升高，浸泡24 h组血糖降低，浸泡12 h组血糖与正常对照组比较差异有统计学意义(P>0.05)。烧伤浸泡组ACAC与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，与单纯烧伤组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。烧伤浸泡组Hb逐渐升高，烧伤浸泡6、12、24 h组Hb与正常对照组、单纯烧伤组比较差异有统计学意义(P均<0.05)。见表3。

表3 各组应激及组织代谢、缺氧指标比较

2.4 各组血离子水平比较 烧伤浸泡2 h组血钠、氯较正常对照组高(P均<0.05)，烧伤浸泡6、12、24 h组血钠、氯较正常对照组、单纯烧伤组高(P均<0.05)。烧伤浸泡2 h组血钾、钙较正常对照组高(P均<0.05)；烧伤浸泡2、6 h组血磷、镁升高，血镁较正常对照组高(P<0.05)，血磷较正常对照组、单纯烧伤组高(P均<0.05)。烧伤浸泡12、24 h组血钾、钙、磷、镁与正常对照组、单纯烧伤组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表4。

表4 各组血离子水平比较

2.5 各组肝、肺、肠组织病理学改变比较 肝脏组织病理改变：正常对照组肝小叶结构完整清晰，肝细胞形态结构正常；单纯烧伤组肝细胞肿胀，胞质疏松，甚至空泡化或嗜酸性变，肝窦变窄，肝窦腔内有多形核白细胞聚集；烧伤浸泡24 h组肝细胞线粒体退变，大量脂质小体形成，核皱缩,异染色质边集，窦内皮细胞高度肿胀。肺脏组织病理改变：正常对照组肺组织结构正常，肺间质及肺泡壁无水肿；烧伤组肺组织结构被破坏，有少部分肺间质及肺泡壁轻度水肿；烧伤浸泡24 h组有明显肺间质及肺泡腔水肿，红细胞溢出，肺泡间质增厚，炎性细胞浸润；小血管周围间隙增宽，并可见片状出血。肠组织病理改变：正常对照组肠黏膜形态正常，肠黏膜绒毛结构完整，绒毛排列整齐，上皮细胞排列整齐，间质无水肿；肠黏膜绒毛破坏明显，绒毛顶端上皮有片状坏死、脱落绒毛间质疏松，间质充血及炎细胞浸润。

2.6 各组肝、肺、肠组织中Caspase-3、Bcl-2蛋白表达比较 正常对照组肝、肺、肠组织中Caspase-3蛋白阳性表达率均为0，单纯烧伤组分别为12.5%(1/8)、37.5%(3/8)、50%(4/8)，烧伤浸泡24 h组分别为50%(4/8)、100%(8/8)、100%(8/8)，各组肝、肺、肠组织中Caspase-3蛋白阳性表达率比较差异有统计学意义(P均<0.05)；正常对照组肝、肺、肠组织中Bcl-2蛋白阳性表达率均为100%，单纯烧伤组分别为37.5%(3/8)、50%(4/8)、37.5%(3/8)，烧伤浸泡24 h组均为0。各组肝、肺、肠组织中Bcl-2蛋白阳性表达率比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

3 讨论

海水中含有高浓度的钠、钾、氯离子[6]及大量致病菌[7]，同时还具有低温、强散热的特性。研究表明，烧伤合并海水浸泡会造成机体高渗性脱水、电解质紊乱、酸碱失衡、血流动力学紊乱，加重组织缺血、缺氧性损害[8]。文献报道胸部开放伤后海水浸泡可对大鼠、猪、狗等实验动物的呼吸、循环系统及全身水、电解质平衡造成严重影响，甚至引起MODS[9]。

肝脏是机体物质代谢最旺盛的器官之一，当机体遭受创伤而发生应激反应时，肝脏细胞会首先受到影响。其中ALT、AST的活性可反映肝细胞受损情况。本研究中大鼠烧伤合并海水浸泡组血液中ALT、AST水平比正常对照组、单纯致伤组高，表明其肝脏组织受损，有炎症细胞浸润，进而影响机体正常的代谢功能。

UA、SCr及BUN是临床常用的反映肾功能的指标。其中UA可反映肾小球的滤过功能。本研究中烧伤合并海水浸泡组BUN较正常对照组和单纯致伤组高。BUN变化较灵敏，可反映早期肾功能不全，当机体主要脏器出血及机体严重缺水时，BUN会显著升高。LDH催化碳水化合物代谢中无氧酵解的最终反应，其广泛存在于各种组织和器官内，细胞受损伤后将多种酶释放到细胞外，其活力与细胞损伤程度呈正相关。由于烧伤合并海水浸泡导致大鼠主要脏器处于缺水、缺血及缺氧等应激状态，受损细胞释放大量的LDH进入血液，故血清LDH水平升高。而烧伤合并海水浸泡组UA和SCr水平虽有改变，但变化不大，与正常对照组比较差异无统计学意义。有研究认为，肾滤过率低于50%时SCr才会明显升高[10]。这可能由于肾脏抗应激能力强，在一定范围内可维持内环境的相对稳态。

创伤后组织会存在缺血缺氧改变。ACAC及LAC是反映机体组织循环障碍及缺氧的指标。本研究烧伤合并浸泡组LAC虽升高但差异无统计学意义，而ACAC变化显著。当缺血缺氧时，机体进行无氧代谢产生乳酸，乳酸再形成大量的ACAC，而ACAC形成糖原的能力变弱，故机体堆积大量的ACAC，导致血液中ACAC水平升高。此外，当烧伤合并海水浸泡后，组织细胞和红细胞受损，会释放大量的炎症介质和Hb，故血清中hs-CRP和游离Hb相应升高。

钾、钙、磷、镁、氯、钠等离子是组成人体重要的物质。烧伤合并浸泡组血离子水平较正常对照组、单纯烧伤组高。血液中钙、磷、镁、钾水平依赖于肠道及肾脏调节。调控钙、磷代谢的激素有甲状旁腺素、甲状腺素等，其相互作用可维持血液离子浓度的正常水平。当机体受到创伤时，大量失血及缺氧等应激因素造成肠、肾、激素功能失调，进而引起血液中钙、磷、镁、钾等离子水平变化。

Bcl-2、Caspase-3与细胞凋亡密切相关，二者主要位于细胞质内。其中Caspase-3属于白细胞介素1β转换酶家族，是细胞凋亡的执行者[11]。Bcl-2是一种与膜稳定性相关的蛋白，通过细胞催化抗氧化作用、离子通道蛋白和吸附/锚定蛋白，抑制Caspase-3的活化，阻断细胞凋亡，提高细胞存活能力[10]。正常情况下，Caspase-3以无活性酶原形式存在，被激活为活性的Caspase-3时可引起细胞凋亡。本研究烧伤浸泡组肝、肺、肠组织结构和细胞形态变化最大，肝、肺、肠组织中Caspase-3蛋白阳性表达率最高、Bcl-2蛋白阳性表达率最低。严重烧伤合并海水浸泡导致消化道血供急剧减少，组织毛细血管微循环障碍，缺血缺氧引起酸中毒，自由基和炎性介质等水平升高，与凋亡相关的基因表达增强，启动了内源性和外源性及其他细胞凋亡激活途径，诱导内皮细胞、淋巴细胞和肠黏膜上皮细胞凋亡，肠黏膜上皮细胞稳态被打破，产生一系列级联反应，诱发脓毒症及MODS[12]。

海水浸泡会加重烧伤后肝、肺及肠道组织结构破坏和屏障功能损伤。在致伤浸泡短时间内海水温度较低，因此还是保护因素。本研究部分结果也提示烧伤浸泡2 h组肝肾功能指标较单纯烧伤组有改善，但随着浸泡时间的延长，机体损伤加重。严重烧伤后主要组织脏器缺血、缺氧，使组织中细胞保护因子水平降低，组织自我修复及保护功能减弱；而大量增加的炎症介质促进细胞凋亡。此外海水高致病菌、高盐、低温及强散热作用引起高渗性脱水、电解质紊乱、血流动力改变和心功能损害。因此，烧伤合并海水浸泡会加重肠道、肺脏及肝脏等的损伤，但机体对烧伤合并海水浸泡后的调节机制，特别是对内分泌的调节机制，尚不清楚，需进一步研究。