纳米银离子敷料对兔Ⅱ度烧伤的治疗效果

王亚菲，赵永健，赵全，孙健

(南开大学附属医院天津市第四医院，天津300222)

烧伤患者病情多变，易引起全身感染，严重者甚至危及生命[1,2]。临床对于Ⅱ度烧伤患者以全身应用抗生素治疗为主，但药效难以到达烧伤创面，且具有治疗费用昂贵、致残率高等缺点。因此，对创面进行及时有效地处理可大大降低创面感染的发生率，缩短创面愈合时间，减轻患者痛苦[3]。随着对烧伤的不断研究，外敷药物治疗烧伤逐渐应用于临床。纳米银离子敷料作为一种新型的抗菌材料在临床中备受关注[4]。2017年12月～2018年5月，本研究构建烧伤动物模型，观察不同浓度纳米银离子敷贴治疗兔Ⅱ度烧伤的疗效及抗菌能力，以指导临床应用。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 健康成年新西兰白兔120只，5月龄，体质量2.0～2.5 kg，购自天津山川红实验动物科技有限公司。原子吸收分光光度计购自美国热电公司；曲拉通X-100、盐酸、双氧水、氨基甲酸乙酯以及硝酸等均购自国药集团；DMEM培养基、黄色葡萄球菌营养肉汤购自美国Invitrogen公司；银标准储备液购自国家环保总院标准样品研究所；MTT试剂盒购自上海碧云天公司。

1.2 模型构建 新西兰兔背部两侧常规备皮，备皮范围20 cm×15 cm。1 d后，静脉注射20%氨基甲酸乙酯溶液1 g/kg，固定于实验操作台上。将直径1.8 cm，重200 g的棉垫置于100 ℃的沸水中，水沸腾后，将棉垫迅速覆盖于备皮部位，静止20 s。共造成背部两侧各3个直径为1.8 cm的圆形烫伤伤口，之后迅速注射灭菌生理盐水20 mL，构建Ⅱ度烧伤模型，活检表明伤及真皮层，创面红白色相间，可见网状栓塞血管，证明建模成功。

1.3 纳米银离子敷料制备 取10 cm×10 cm纱布，常规灭菌。用Paladini等[5]的硝酸银原位光还原法将银离子定植于纱布上。方法：制备硝酸银溶液，将溶液固定于纱布上，之后采用365 nm的紫外光照射。将纱布分别置于0.5%、1%以及2%的硝酸银甲醇溶液中浸泡1 min，之后迅速置于365 nm紫外灯下(500 W)照射，紫外灯距纱布20 cm。纱布两面分别照射20 min后，去离子水清洗纱布，置于60 ℃烘箱中2 h，将纱布烘干。

1.4 动物分组及治疗方法 将烧伤模型随机分为对照组及0.5%、1%、2%银离子组各30只，其中对照组外敷凡士林纱布并包扎，0.5%、1%、2%银离子组分别外敷相应纳米银离子纱布。各组每天换药1次，7 d为1个疗程，连续治疗3个疗程。观察创面愈合情况。当创面愈合率高于95%时，视为完全愈合。创面愈合率=(造模面积-未愈合面积)/造模面积×100%。

1.5 纱布细菌定量检测 用吸光光度法在治疗第1、6、9、15、21天，将外敷后的纱布剪成1 cm2碎片，置于含2 mL金黄色葡萄球菌营养肉汤的24孔板中，37 ℃条件下孵育过夜。取样品用PBS缓冲液洗涤3次，移除表面未附着细菌，将样品转移至含2 mL无菌PBS的容器中，用涡旋器处理样品2 min以分离细菌，37 ℃条件下孵育4 h。吸取样品溶液，用分光光度计测量波长600 nm处的吸光度(OD)，实验重复3次。将吸光度值换算为菌落形成单位：1 OD600=1.5×108CFU/mL[6]。

1.6 敷料抗菌能力检测 用MTT法检测敷料浸出物细胞毒性。将人角质形成细胞HaCaT接种于DMEM培养基，并补充10%胎牛血清及链霉素、青霉素。接种细胞前，向培养基中加入敷料浸出物。浸出物制备方法：将0.4 g处理或未处理过的纱布浸泡于10 mL磷酸盐缓冲液中，37 ℃下保持24 h，之后用0.22 μm的滤膜过滤除菌，并将pH调整到7.4。加入浸出物后，将细胞(2×105/mL)接种至24孔板中，在37 ℃条件下孵育。24 h后，更换为新鲜DMEM培养基，每孔加入0.5 mg/mL的MTT试剂，再加入DMSO溶解结晶物。检测波长550 nm处的OD，计算细胞活力。

1.7 兔体内银离子浓度测量 采用周乐舟等[7]的石墨炉原子吸收光谱法。血清中银离子检测：治疗结束后将白兔处死，取其心脏血液，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集，于4 ℃冰箱中冷藏保存。测定前将血样品取出，置于25 ℃条件下30 min，振荡混匀后取血清100 μL，加入0.2%曲拉通X-100 0.9 mL，混合均匀，按照仪器操作说明检测血清银离子浓度。大脑及肾组织中银离子检测：治疗结束后，处死白兔，收集大脑及肾组织。测定前，取出样品，去除表面污垢，充分破碎。取大脑及肾脏组织各0.5 g，加入双氧水2 mL、硝酸5 mL，振荡混合均匀，4 ℃条件下处理1 h，150 ℃高温消化至干。将消化物稀释至5 mL，在指定条件(波长：328.1 nm，狭缝宽度：0.5 nm，电流5 mA)下检测大脑及肾组织中银离子浓度。

2 结果

2.1 各组创面愈合时间比较 对照组及0.5%、1%、2%银离子组伤口愈合时间分别为(20.6±1.7)、(16.2±1.7)、(15.8±1.6)、(16.8±1.3)d，0.5%、1%、2%银离子组愈合时间较对照组短(P均<0.05)，但不同浓度银离子组伤口愈合时间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

2.2 各组敷料抗菌能力比较 治疗第1、3、9、15、21天，0.5%、1%、2%银离子组菌落形成数较对照组少(P均<0.05)。但不同浓度银离子组之间菌落形成数比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组敷料上菌落形成数比较

2.3 各组敷料细胞毒性比较 对照组及0.5%、1%、2%银离子组细胞活力分别为100%±7.6%、86.3%±4.7%、20.7%±1.3%、17.6%±1.5%。0.5%、1%、2%银离子组细胞活力较对照组低(P均<0.05)，1%、2%银离子组细胞活力较0.5%银离子组低(P均<0.05)；1%与2%银离子组细胞活力比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 各组血清及大脑、肾组织中银离子水平比较 银离子主要分布于实验动物的血清及大脑、肾脏中。同组血清及大脑、肾组织中银离子水平比较差异有统计学意义(P均<0.05)；三组大脑、肾脏银离子水平比较差异有统计学意义(P均<0.05)，三组血清银离子水平比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组血清及脏器中银离子水平比较

3 讨论

Ⅱ度烧伤是指烧伤程度到达整个表皮、生发层以及真皮乳头层[8]。临床主要以保守和手术治疗为主，前者主要采取创面包扎的治疗方式，促使创面愈合，但感染发生率较高，容易造成深层组织得到破坏；后者可能会造成创面二次损伤且患者不易接受。若烧伤创面未及时处理或处理方式不正确极易引起感染及脓毒症等并发症，严重者可导致患者死亡。对于局部和全身反应较重的患者，常规给予静脉用药(抗生素)来控制感染，但其临床效果不佳且患者易发生耐药现象。早期应用抗菌药物控制创面细菌生长，加速创面愈合，成为治疗烧伤的首选。

纳米银离子敷料在国内外广泛应用，如Silver等[9，10]将纳米银与壳聚糖结合制作敷料，应用于烧烫伤伤口，可明显抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等多种细菌微生物；李晓鲁等[11]通过给予观察组患者爱银康进行治疗，对照组给予磺胺嘧啶银敷料，其结果显示观察组治疗效果明显优于对照组，愈合率也明显提高。说明纳米银离子在治疗烧伤中具有较好的抑制细菌、促进创伤面愈合效果。因此，本研究通过构建Ⅱ度烧伤动物模型作为研究对象，分析纳米银离子敷贴对Ⅱ度烧伤患者的临床治疗效果，并采用不同浓度的纳米银离子敷料治疗Ⅱ烧伤，以此分析选择最合适纳米银离子用量。

烧伤后创面愈合主要包括三个过程，即炎症反应、细胞增殖及组织重建。1962年提出“湿润环境愈合理论”，并发明湿性疗法，利用其湿性环境促进生长因子释放以及细胞增殖进而加快创面愈合[12]。低氧环境对成纤维细胞的增殖尤为重要，烧伤创面在封闭状态环境下呈弱酸性，其弱酸环境有利于成纤维细胞产生胶原，其胶原又是肉芽组织的主要成分，因此低氧湿润环境下可促进烧伤患者的创面愈合。本研究对照组给予外敷凡士林纱布包扎，凡士林纱布具有下列优点：保护创面不被污染；可有效避免创面神经末梢损伤，并在一定程度上可缓解烧伤疼痛；具有保温作用。而观察组应用纳米银离子敷料，该敷料是一种湿性敷料，较之传统敷料和药物有着一定优势，其具有不良反应小、抗菌活性强、促进创面愈合等优点。纳米银离子还具有强大的抗菌能力，可杀死细菌、真菌等病原微生物。纳米银离子敷料的抗菌原理如下：可与带阴电荷的菌体蛋白质结合，进而抑制巯基酶的活性；纳米银与细菌DNA碱基相结合，导致DNA变性；烧伤创面通常可产生基质金属蛋白酶，纳米银离子有效抑制基质金属蛋白酶的产生[13]。相关文献报道证实，纳米银离子敷料可杀死金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等多种致病菌[14]。通过将载体材料与纳米银完好的结合，使其与创面接触后可持续不断释放银离子，达到持久的抗菌效果，从而促进创面愈合。

本研究结果显示，纳米银离子敷料治疗后，兔伤口愈合时间明显短于对照组。这提示纳米银离子敷料可有效促进创面愈合，与韩立峰等[15]研究的结果相似；但不同浓度银离子组伤口愈合时间比较差异无统计学意义，说明提高银离子浓度并不能加快伤口的愈合时间。另外，通过对敷料上的细菌进行计数发现，银离子组在各个时间点的菌落形成单位都明显低于对照组，这与孙羽飞等[16]的研究结果相似，可见纳米银离子敷料具有明显的抗菌作用。为了进一步探究纳米银离子敷料在治疗Ⅱ度烧伤的疗效以及其合适的使用浓度，检测了不同浓度纳米银离子对于细胞的毒性，结果显示浓度越高，毒性越强。另外，由于银离子进入体内对人体有害，纳米银离子浓度越高，大脑和肾脏中的银离子水平越高。

综上所述，纳米银离子敷料治疗Ⅱ度烧伤效果良好，能有效促进伤口愈合，具有一定的抗菌能力；但纳米银离子浓度越高，其细胞毒性越强。