邻香草醛缩5-氨基水杨酸钕配合物对S.Pombe生长代谢的影响研究

蒋建宏，邹柔，周杰，黎泰玲，于梦粤，瞿沙，何小凤，邓斌*

(1.湘南稀贵金属化合物及其应用湖南省重点实验室，湖南 郴州 423043；2.湘南学院 化学生物与环境工程学院，湖南 郴州 423043)

邻香草醛本身具有抗菌活性，能够治疗和预防疾病，而水杨醛类Schiff碱配合物更是具有良好的抗癌、抗炎作用，使得该类配合物在近年掀起一阵研究热潮.长期一直被作为临床药物广泛使用的5-氨基水杨酸具有杀菌消炎、解热止痛等多种医学作用[1-2].从配位化学的角度，5-氨基水杨酸与邻香草醛合成的Schiff碱含有多个强电负性的氮、氧配位原子，致使其配位能力极强并且能够形成各式各样的配位方式，能够以金属离子作为中心原子键合形成稳定的配合物，具有一定的意义.此外，稀土元素与有机分子形成配合物现已被证实具有抗菌、抗肿瘤和抗病毒[3-4]等生物活性，并有研究证明配体的生物活性在形成配合物以后会增强到不同的程度且毒性减弱[5].现今已有多种自由基抑制剂、催化剂和氧载体都是由稀土Schiff碱配合物制得[6].故此类配合物的合成不论是对配位化学还是医学研究上寻找高效低毒的药物，都体现出不可小觑的意义.

有关邻香草醛缩5-氨基水杨酸钕配合物的研究中，已有文献合成并表征了其结构[7]，但其抗菌作用至今未见报道.在微生物耐药性蔓延的今天，研究配合物的抗菌活性，可为抗菌类药物的研发和筛选提供一定的参考价值.粟酒裂殖酵母细胞(S.Pombe)的生长周期与高等动物真核细胞非常类似，以它为研究对象做与真核细胞生物相关的研究探索是个绝佳的选择[8].鉴于此，本文参照文献[7]合成邻香草醛缩5-氨基水杨酸钕配合物，并利用生物微量热法探讨其对S.Pombe生长的影响.

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

Avatar360型傅里叶变换红外光谱仪(美国Nicolet公司)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；2400 Series II CHNS/O元素分析仪(美国PerkinElmer公司)；3116-2/3239TAM Air八通道热导式等温微量热仪(瑞典Thermometric AB公司).

邻香草醛(百顺(北京)化学科技有限公司，AR)；5-氨基水杨酸(安徽酷尔生物工程有限公司，AR)；无水乙醇(长沙有机试剂厂，AR)；六水合氯化钕(国药集团化学试剂有限公司，AR).

粟酒裂殖酵母细胞(S.Pombe)，由西班牙萨拉曼卡大学(University of Salamanca)Faustino Mollinedo教授惠赠.

1.2 培养基

YES培养基，成分如下：酵母粉10.0000 g，葡萄糖60.0000 g，L-Leu 0.4500 g，L-Lys 0.4500 g，L-His 0.4500 g，尿嘧啶0.4500 g，腺嘌呤0.4500 g，均匀溶解于2 L三重蒸馏水中，分装于三角瓶后用牛皮纸密封，在121 ℃下进行高压灭菌20 min备用.

1.3 Schiff碱及其配合物的制备

1.3.1 邻香草醛5-氨基水杨酸Schiff碱的制备

称取10 mmol(1.531 g)5-氨基水杨酸，充分溶解于30 mL无水乙醇，然后逐滴加入10 mmol(1.521 g)邻香草醛的无水乙醇溶液.在室温下避光搅拌3 h生成桔红色沉淀.过滤后将沉淀用无水乙醇进行重结晶，真空干燥，得到红色固体.

1.3.2 邻香草醛缩5-氨基水杨酸钕配合物的制备

称取3 mmol(0.862 g)新制邻香草醛5-氨基水杨酸Schiff碱配体，加热回流使其溶解在60 mL无水乙醇中，然后逐滴加入10 mL含1 mmol六水合氯化钕的无水乙醇溶液，立即产生桔黄色沉淀，80 ℃下回流搅拌3 h后，冷却，过滤，用无水乙醇洗涤产物直至洗涤液体无Cl-，真空干燥至恒重.

1.3.3 红外光谱

图1 邻香草醛、5-氨基水杨酸、配体及其钕配合物红外光谱图Fig.1 IR spectra of O-vanillin，5-aminosalicylic acid，ligand and its neodymium complex

将样品研细后取约2 mg，与100～200 mg干燥KBr粉末充分研磨均匀，取适量使之在模具中均匀分布，压成光滑的透明薄片.在KBr的参比下对药品进行红外光线扫描.分别测邻香草醛、5-氨基水杨酸、邻香草醛缩5-氨基水杨酸Schiff碱及其钕配合物的在波数为4000-500 cm-1段的红外光谱，如图1所示，所得红外图谱与文献[7]相符.

1.4 配合物对S.Pombe的影响

实验方法和操作步骤依据文献[9]，采用TAM Air热导式等温微量热仪实时监测配合物作用下S.Pombe生长代谢的热功率.

2 结果与讨论

2.1 红外光谱

将采用KBr压片法测得的四种样品在4000-500 cm-1波数段的红外吸收光谱图整合如图1所示.

2.2 元素分析

配合物的C、H、N含量由元素分析仪测得，配合物中的钕含量用EDTA法滴定得出.结果如表1所示，实测值与理论值基本相符.

表1 配合物的元素分析测定结果

2.3 配合物对S.Pombe作用的热动力学研究

2.3.1 S.Pombe的生产热功率曲线

在305.15 K的条件下，分别接种106cell/mLS.Pombe于8个含有5 mL培养基的安瓿瓶中，再依次加入浓度递增的配合物溶液，测得在各浓度配合物影响下的S.Pombe生产热功率曲线如图2(a)所示.

图2(a) 在配合物作用下S.Pombe的生产热功率曲线Fig.2(a) Thermal power curves of S.Pombe under different concentrations complex

图2(b) 无配合物作用下S.Pombe的生产热功率曲线Fig.2(b) Thermal power curve of S.Pombe without complex

a，0 g/L；b，0.0505 g/L；c，0.0673 g/L；d，0.0841 g/L；e，0.1009 g/L；f；0.1177 g/L；g，0.1346 g/L；h，0.1514 g/L；

2.3.2 S.Pombe的生长速率常数k和传代时间tG

分析图2(b)中无配合物作用下细胞生产热功率曲线可以得出，S.Pombe的生长期呈现出固定的规律.其在一段短期的生长停滞之后生长速率大幅度增加，直至达到生产热功率的最高点.S.Pombe大幅度生长阶段称为指数生长期(AB段)，这期间数量增长有如下表示

lnPt=lnP0-kt0+kt

(1)

令(t-t0)=tG，则nt/n0=2，即Pt/P0=2

将式(1)变形得：

ln(Pt/P0)=k(t-t0)

(2)

在(2)式中，Pt表示S.Pombe在t时刻的热释放功率；k表示S.Pombe在指数生长期的生长速率常数；用计算机将指数生长期所对应的曲线线段进行直线拟合，即可得到在不同配合物浓度作用下S.Pombe的生长速率常数k，S.Pombe在不同配合物浓度作用下的传代时间tG(见表2)由公式tG=(ln2)/k计算得到.

2.3.3 S.Pombe的抑制率I和半抑制浓度CI，50

配合物对细胞成长的抑制率有如下表示：

I=(K0-Kc)/K0×100 %

(3)

(3)式的K0表示S.Pombe正常生长状态下的生长速率常数，Kc表示S.Pombe在配合物浓度为c时所对应的生长速率常数.当抑制率达到50 %时所对应的配合物浓度叫做半抑制浓度CI，50.将各配合物浓度下的生长速率常数依次代入公式(3)则可计算得到S.Pombe在不同浓度配合物作用下的抑制率I.将抑制率I与配合物浓度进行Logistic拟合得到曲线方程，令抑制率等于50 %即可算出抑制浓度CI，50(见表2).半抑制浓度直接反映配合物的抗菌活性，抗菌活性越强，对S.Pombe的生长抑制效果越好，配合物的半抑制浓度CI，50越小.邻香草醛缩5-氨基水杨酸钕配合物对S.Pombe的半抑制浓度为0.1314 g/L.

表2 305.15 K时，S.Pombe在不同配合物浓度作用下生长期的热动力学参数

c(g/L)，配合物浓度；k(s-1)，生长速率常数；I(%)，抑制率；tmax(s)，达到最大发热功率所需时间；tG(s)，传代时间；R，线性匹配相关系数.

c(g/L)，The concentrations of complex；k(s-1)，Growth rate constant；I(%)，Inhibition ratio；tmax(s)，Maximum heating power time；tG(s)，The generation time；R，The linear matching coefficient.

2.3.4 生长速率常数k与浓度c的关系

由公式(2)可知，生长速率常数k与热输出功率的自然对数ln(Pt/P0)成正比，即S.Pombe在指数生长期的产热功率越大，k值就越大.经过分析得出S.Pombe在上述不同配合物浓度下的生长速率常数k后，作出点状图并进行Logistic曲线拟合，如图3所示，可直观看出，随着配合物的浓度逐渐增大，生长速率常数k值呈下降趋势，即说明配合物的存在抑制了S.Pombe的生长.

由图3可得到曲线方程：

[0≤c(配合物)≤0.1514 g/L]；相关系数R=0.9824

2.3.5 抑制率I与浓度c的关系

将配合物对S.Pombe生长的抑制率I与相应浓度c的点状图进行Logistic曲线拟合得到图4.从图中可以看出，随着配合物浓度的增加，配合物对S.Pombe的抑制率呈上升趋势，说明配合物抑制作用的强度随着浓度的增大而增大.

图3 S.Pombe的生长速率常数k与配合物浓度c的关系Fig.3 Growth rate constant(k)of S.pombe with different concentrations of complex

图4 配合物对S.Pombe的抑制率I与配合物浓度c的关系Fig.4 Inhibition ratio(I)of S.pombe with different concentrations of complex

由图4可得直线方程：

[0≤c(配合物)≤0.1514 g/L]；相关系数R=0.9824

2.3.6 传代时间tG与浓度c的关系

将S.Pombe的传代时间tG与配合物浓度c的点状图进行Logistic曲线拟合得到图5.由图5可知，当配合物浓度的逐渐变大时，S.Pombe所需要的传代时间tG越长，表明配合物使得S.Pombe的生长速度变得缓慢，而且浓度越大，传代所需时间越长.

由图5可得到曲线方程为：

[0≤c(配合物)≤0.1514 g/L]；相关系数R=0.9760

2.3.7 达到生长代谢最大功率所需时间tmax与浓度c的关系

将S.Pombe的生长达到顶峰也就是生长热曲线的顶点所需的时间tmax与配合物浓度c的点状图进行Logistic曲线拟合，如图6所示关系.由图6可知，随着配合物浓度的增加，S.Pombe达到生长代谢最大功率所需的时间tmax越长，同样说明其生长速度在逐渐变得缓慢.

图5 S.Pombe传代时间tG与配合物浓度c的关系Fig.5 The generation time(tG)of S.pombe with different concentrations of complex

图6 达到S.Pombe生长代谢最大功率所需时间tmax与配合物浓度c的关系Fig.6 Maximum heating power time(tmax)of S.pombe with different concentrations of complex

由图6可得到曲线方程为：

[0≤c(配合物)≤0.1514 g/L]；相关系数R=0.9977

3 结 论

本实验依照原有文献合成了邻香草醛缩5-氨基水杨酸钕配合物，运用TAM Air微量热仪实时监测得配合物在305.15 K时对S.Pombe生长代谢热曲线，继而分析了S.Pombe在不同配合物浓度作用下的多项热动力学参数.实验结果表明：当配合物的浓度逐渐增加时，S.Pombe的生长代谢速率常数k渐渐缩小而达最大发热功率的时间tmax、传代时间tG和抑制率I都呈现增长趋势，求解得到半抑制浓度CI，50为0.1341 g/L.实验得出结论：配合物能够抑制S.Pombe的生长，并且抑制程度正相关于配合物的量.其以何种方式对细胞的生长进行抑制还有待进一步探索研究.