河南华溪蟹金属硫蛋白的GST融合表达及工程菌吸附重金属的研究

王琪，王兰，马文丽

山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006

金属硫蛋白（metallothionein，MT）广泛存在于动物、植物和微生物体内，是富含半胱氨酸的小分子金属结合蛋白，结构保守，对多种金属有高度亲和性[1-2]。多个研究表明，MT能特异地与锌、铜、镉等重金属结合，在解除重金属毒性方面起重要作用[3-4]，并且发现MT可以清除体内自由基，具有延缓衰老、抗肿瘤等重要功能[5-6]，所以金属硫蛋白具有重大研究价值和广阔的应用前景。

河南华溪蟹（Sinopotamon honanense）由海洋蟹多元转化而来，广泛分布于我国长江及黄河流域淡水水体基底层，直接面对沉积在水体内的重金属离子，其组织中的MT含量可以作为一种监测水体重金属暴露的生物标志物。在前期研究中，我们从河南华溪蟹中分离纯化了MT并克隆了其cDNA全长序列，进一步研究了不同金属胁迫下MT的组织细胞定位[7-8]。本研究旨在选择合适的表达载体，获得MT的体外稳定表达，为MT的规模化制备奠定基础。

His-tag（由6～10个组氨酸残基组成）和GST-tag（谷胱甘肽巯基转移酶）是目前原核表达系统中最常见的2种融合蛋白标签。已有研究者通过融合6×His标签制备重组MT，但因为MT相对分子质量仅为6000～7000，而His-tag的相对分子质量也很小，以致重组后的6×His-MT蛋白分子太小，在大肠杆菌系统中表达不稳定，诱导产物往往为无功能蛋白[9-10]。与6×His-tag相比，GST-tag相对分子质量较大，约为26 000，可提高目标蛋白的稳定性，适用范围广，能在不同的宿主中表达。因此，本实验选择GST-tag作为融合蛋白标签，采用基因克隆方法构建pGEX-6p-1-MT重组质粒，转入大肠杆菌诱导表达融合蛋白GSTMT。通过火焰原子分光光度法进一步研究了重组菌体对重金属的生物吸附能力，旨在为重金属污染治理提供新的方法及手段。

1 材料与方法

1.1 MT全长编码区基因的扩增

根据MT cDNA序列及表达载体pGEX-6p-1的多克隆位点，设计带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物。上游引物为5′-CGGGATCCATGCCTG ATCCTTGC-3′，下划线序列为BamHⅠ酶切位点，ATG是起始密码子，CG为保护碱基；下游引物为5′-CCCTCGAGTTATCAGGGGCAGCAG-3′，下 划 线序列为XhoⅠ酶切位点，TTATCA是2个终止密码子，CC为保护碱基。以MT cDNA序列为模板进行PCR扩增（扩增条件：预变性94℃ 3 min；变性94℃ 30 s，退火 50℃ 30 s，延伸 72℃ 1 min，30个循环；延伸72℃ 10 min），PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，用胶回收试剂盒回收。

1.2 pMD19-T-MT载体克隆

将回收的PCR产物与pMD19-T载体（购自TaKaRa公司）连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α后进行蓝白斑筛选，扩大培养白色单克隆并提取质粒，用BamHⅠ和XhoⅠ酶切提取的质粒，琼脂糖凝胶电泳检测，经生工生物工程（上海）股份有限公司测序验证。

1.3 pGEX-6p-1-MT表达载体的构建

BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pMD19-T-MT载体和pGEX-6p-1表达载体（本实验室保存），凝胶电泳检测，胶回收酶切产物；用T4DNA连接酶将MT基因连接到pGEX-6p-1上，获得重组质粒；将此重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，在含氨苄西林（Amp，50 mg/L）的LB培养基中扩大培养，经菌液PCR检测，提取质粒交生工生物工程（上海）股份有限公司测序验证。

1.4 GST-MT融合蛋白的诱导表达

将测序正确的pGEX-6p-1-MT重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21（DE3），37℃、180 r/min振荡培养16 h后，按1∶100接种到含Amp（50 mg/L）的新鲜培养基中扩大培养，待菌液D600nm≥0.6时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG溶液诱导6 h，4℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清，PBS重悬菌体，加入PMSF蛋白酶抑制剂超声波破碎，1 h后16 000 r/min离心15 min，取上清液进行SDS-PAGE分析鉴定。

1.5 转MT工程菌对重金属的生物吸附能力检测

将表达菌体与对照菌株（仅含空载体pGEX-6p-1）按1∶100接种至50 mL新鲜培养基（含50 mg/L Amp）中扩大培养，当菌液D600nm≥0.6时加入IPTG诱导蛋白表达，同时分别加入300 μmol/L的ZnSO4、CdCl2和 CuSO4溶液，37℃、200 r/min振荡培养6 h，4℃、12 000 r/min离心10 min收集菌体，用新鲜的LB洗涤2次，80℃处理48 h后称量菌体干重并用超纯水重悬、定容。利用火焰原子分光光度计分别测定转MT工程菌及对照菌体对Zn2+（213.9 nm）、Cu2+（324.8 nm）和Cd2+（228.8 nm）的生物吸附，以菌体干重（DW，μmol/g）表示。

1.6 数据分析

实验平行做3次，结果以x±s表示。用SPSS 19.0软件统计分析，采用单因素方差分析进行工程菌和对照菌株的差异显著性分析。

图1 PCR扩增河南华溪蟹MT基因琼脂糖凝胶电泳图

图2 pMD19-T-MT和pGEX-6p-1的双酶切琼脂糖凝胶电泳图

图3 融合蛋白GST-MT表达的SDS-PAGE分析

图4 转MT工程菌对重金属的生物吸附

2 结果

2.1 MT全长编码区基因的扩增

以实验室前期构建的pET-28a-MT为模板进行PCR扩增，得到的目的片段条带清晰，大小约为190 bp，符合MT基因的理论值（图1）。

2.2 pMD19-T-MT与表达载体pGEX-6p-1的双酶切

将目的片段胶回收连接到pMD19-T质粒上，经蓝白斑筛选，挑取白色菌落扩增，提取质粒pMD19-T-MT。用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切pMD19-T-MT和pGEX-6p-1载体，凝胶电泳检测条带明显且符合理论值（图2）。胶回收酶切产物。

2.3 重组表达载体pGEX-6p-1-MT的鉴定

将双酶切的目的片段与表达载体连接，构建重组载体pGEX-6p-1-MT，菌液PCR检测并送生工生物公司测序（序列略），测序结果表明目的片段正确，无突变，证明重组载体pGEX-6p-1-MT构建成功。

2.4 融合蛋白GST-MT的诱导表达

取超声波破碎后的菌体上清液，SDS-PAGE分析融合蛋白GST-MT的表达情况，结果如图3。目标蛋白获得可溶性表达，相对分子质量约为33 000，与预期一致（GST的相对分子质量约为26 000，MT的相对分子质量为6000～7000）。

2.5 转MT工程菌重金属生物吸附能力检测

用火焰原子分光光度计分别测定工程菌对Zn2+、Cu2+和Cd2+的吸附能力，结果见图4。空菌体和工程菌吸附Zn2+的能力分别为0.22、0.808 μmol/g，单因素方差分析表明工程菌的吸附能力极显著高于空菌体（P＜0.01）。空菌体和工程菌吸附 Cd2+的能力分别为 0.618、1.34 μmol/g，方差分析显示工程菌的生物吸附能力极显著增加（P＜0.01）。空菌体和工程菌吸附Cu2+的能力分别为0.206、0.528 μmol/g，方差分析得知工程菌的生物吸附能力极显著高于空菌体（P＜0.01）。3种重金属中，工程菌对Cd2+的吸附能力最强，其次是Zn2+和Cu2+，可能源于我们最初从河南华溪蟹中克隆得到的为镉诱导的MT cDNA。

3 讨论

MT分子很小，且富含半胱氨酸，半衰期短，在大肠杆菌体内不稳定，极易形成无生物活性的包涵体。并且因其具有很强的金属结合特性，易螯合体内必需金属元素而对宿主细胞产生较大的毒性，因此金属硫蛋白的原核表达一直是个难题[11-12]。我们在前期研究中，将河南华溪蟹MT基因克隆至常规表达载体pET-28a及pQE31上，发现其可溶性表达极低，绝大部分以包涵体形式存在。另外，pET-28a及pQE31携带的6×His-tag虽能稳定地与配体特异性结合，但重组蛋白纯化须通过镍柱，而镍柱中的氯化镍含有二价金属离子，可能会与MT结合，影响下一步咪唑洗脱重组。而pGEX-6p-1载体表达的外源蛋白与谷胱甘肽巯基转移酶融合表达，通过GST亲和层析进行纯化，特异性高，纯化方便且温和[13]。重要的是GST-MT重组蛋白在纯化时可以避免与柱填料结合，能以最优条件获得稳定的GST-MT融合蛋白。因此，我们最终选择pGEX-6p-1表达载体，获得了GST-MT的可溶性融合表达，为后续MT的规模化制备奠定了基础。

随着我国经济的高速发展，各种污染物大量排放，使得环境污染日趋严重，对人和动物的安全造成一定影响。减少环境污染、遏制生态环境的恶化成为人们关注的焦点。生物修复技术因其成本低、效果好、无二次污染等优点受到普遍关注，成为环境治理的主要方法和技术[14]，其中利用基因工程菌解决环境中的石油、农药、表面活性剂及重金属污染问题已成为环境污染修复领域的研究热点[15]。近年来也有报道表明金属硫蛋白因其具有高的金属结合能力，在环境污染修复领域具有潜在应用价值[16-17]。本研究探讨了转MT工程菌对重金属的生物吸附作用，结果显示工程菌对Zn2+、Cd2+及Cu2+的生物吸附能力分别为对照菌株的3.62、2.17及2.56倍，均呈极显著差异。在3种重金属中，转MT工程菌对Cd2+的吸附能力最强，推测与我们最初克隆的为镉诱导华溪蟹MT cDNA有关。由于金属溶液浓度过高会胁迫菌体，使菌种快速死亡，所以在进行转MT工程菌吸附重金属实验时，需要注意配制的金属溶液的浓度。综合各种因素，实验最终选择使用的金属离子溶液浓度为300 μmol/L。

综上所述，我们实现了河南华溪蟹MT的GST融合表达，为利用基因工程技术大规模制备MT奠定了基础；同时转MT工程菌显著增强了吸附重金属的能力，为重金属污染修复提供了新的技术手段。