一株吡咯喹啉醌产生菌的筛选和初步鉴定

杨亚欣，刘天，李彤，孙晓宇，汪建华，熊向华，张惟材，葛欣

1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071000；2.军事科学院 军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100071

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ），化学名称为4，5-二氢-4，5-二氧化-1-氢吡咯（2，3f）醌-2，7，9-三羧酸，是继吡啶核苷酸和核黄素核苷酸之后第3种氧化还原型辅酶，能够刺激线粒体再生，促进神经生长因子生成，具有抗氧化、促进认知、增强体能等功能[1-4]，有人提出应列为B族维生素中的新成员[5]，具有良好的开发前景。

PQQ合成包括化学合成和生物合成，化学合成需要11步反应和5步纯化，步骤多、产率低且污染环境；而生物合成步骤少、周期短、成本低，是工业化生产的惟一可行路线。PQQ产生菌均为革兰阴性菌，其中以甲醇为惟一碳源的甲基营养菌的PQQ产量最高。我们采集了不同地区的土壤样品，利用甲醇选择培养基富集培养，通过NBT染色和Native-PAGE法筛选得到1株产量为13.3 mg/L的PQQ产生菌，经鉴定为生丝微菌（Hy⁃phomicrobium），命名为生丝微菌T28。

1 材料与方法

1.1 材料

甲基营养菌 MP688（Methylovorussp.MP688）由本实验室保存；琼脂糖凝胶DNA回收纯化试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；DNA聚合酶、DNA marker购自北京全式金生物技术有限公司；山梨糖脱氢酶（SDH）由本实验室表达纯化获得；测序及PCR引物合成由北京华大基因科技股份有限公司完成；其他生化试剂（分析纯）均购自国药集团。培养基成分见表1～5。

10×非变性缓冲液：Tris amino 30.3 g，甘氨酸144.0 g，pH8.8，定容至1 L。

5×非变性上样缓冲液：1 mol/L Tris-HCl（pH6.8）12.5 mL，溴酚蓝250 mg，甘油25 mL，加水定容至50 mL。

1.2 NBT染色法筛选PQQ产生菌[6]

取5 g土样于10 mL无菌水中充分振荡摇匀，静置后取1 mL悬液加入盛有25 mL富集培养基的三角瓶中，30℃、200 r/min富集培养48 h；移取1 mL培养液至另一盛有新鲜富集培养基的三角瓶中继续培养，重复富集培养3次；将培养物离心，取 20 μL 上清加 4 μL SDH 和 180 μL NBT检测液于96孔板，观察反应液颜色的变化；选择反应体系变蓝紫色阳性孔的菌液，用无菌水稀释至 1/104～1/108，分别取 10 μL 涂布于平板筛选培养基上30℃培养48～72 h；挑取单菌落于 5 mL HC液体培养基中30℃培养4 d，取1 mL菌液12 000 r/min 离 心 1 min，菌 体用 500 μL 20 mmol/L的Tris-HCl重悬后超声波裂解；裂解液离心后取20 μL上清于96孔板中，加入4 μL脱辅基的 SDH，30℃温育20 min后加入180 μL NBT活性染色液，混匀后观察反应液颜色的变化。

1.3 PQQ产生菌的Native-PAGE法鉴定

PQQ产生菌用HC培养基于30℃培养3 d，取1 mL菌液12 000 r/min离心1 min后弃上清，菌体用500 μL 20 mmol/L Tris-HCl重悬，超声波裂解，裂解菌液16 μL加4 μL 5×非变性上样缓冲液制备样品，进行Native-PAGE。剥离电泳凝胶，放入已加入10 mL蒸馏水、3 mL NBT（2 mg/mL）、3 mL TMB、3 mL PMS（2 mg/mL）、山梨糖少许的90 cm平皿中，37℃避光染色5 min。

1.4 16S rDNA序列扩增与分析[8]

以PQQ产生菌为模板，用16S rDNA通用引物进行PCR，胶回收扩增产物，送北京华大基因科技股份有限公司测序，在NCBI网站进行Blast序列比对分析。

1.5 PQQ产生菌最适培养条件及PQQ产量测定

参考生丝微菌的培养条件[9-10]设计了几种培养基配方（表1～5），考察了甲醇浓度、pH值等对PQQ产生菌生长和PQQ产量的影响。PQQ产生菌按1% 的接菌量接种于1～6号100 mL液体培养基中，30℃、200 r/min摇床培养，每12 h检测菌液D660nm值，绘制菌株在各培养基中的生长曲线，确定生丝微菌T28的最适生长培养基。培养1～3 d，用NBT-Gly法[7]测定PQQ产量；第5～6 d测定菌体离心上清液的D400nm和D326nm值，根据公式PQQ=（D326nm-D400nm）×43.376+0.5126计算PQQ产量。

表1 1～4号培养基

表2 1～4号培养基微量元素

表3 5号培养基

表4 5号培养基微量元素

表5 富集培养基（HC培养基）和6号培养基

2 结果

2.1 PQQ产生菌筛选

从不同地区不同环境采集500余个土壤样品，NBT染色法初筛结果发现15个样品反应体系变成蓝紫色（图1）。从15个样品中选择12个颜色较深的样品进行复筛，结果如图2，发现10个样品的菌体裂解液中含PQQ。

2.2 Native-PAGE鉴定菌株产PQQ

以PQQ标准品为阳性对照，取反应较强的10株菌的菌体裂解液进行Native-PAGE后活性染色，结果如图3，编号6、7菌株上清中存在大量PQQ，对应的菌株名为T28、T4。

2.3 16S rDNA序列比对鉴定菌属

以相对PQQ产量较高的T28菌液为模板，采用16S rDNA通用引物进行PCR，扩增产物核酸电泳条带约1500 bp，与预期相符（图4）。PCR产物直接测序，序列经NCBI Blast比对分析，表明T28 16S rDNA序列与生丝微菌同源性最高为96% ，因而将该PQQ产生菌命名为生丝微菌T28，绘制系统发育树如图5。

图1 PQQ产生菌初筛结果

图2 PQQ产生菌复筛结果

图3 Native-PAGE法定性检测PQQ

图4 PQQ产生菌16S rDNA电泳图

2.4 生丝微菌T28生长最适培养基

考察1～6号培养基对PQQ产生菌生长和PQQ产量的影响，结果如图6、7。1～4号培养基中菌密度（D660nm值）最终未达到1.3，不是T28最适生长培养基；6号培养基培养144 h时D660nm值达3.57，PQQ产量为2.8 mg/L；5号培养基培养144 h时PQQ产量为13.3 mg/L，且D660nm值最高，为3.93。

图5 PQQ产生菌经Blast比对结果绘制的系统发育树

图6 生丝微菌T28生长曲线

图7 生丝微菌T28的PQQ产量

3 讨论

甲基营养菌在PQQ生产中具有很好的前景，本实验室曾筛选得到1株PQQ产生菌食甲基杆菌MP688，经工艺优化和遗传育种PQQ产量超过2000 mg/L。我们还发现该菌的PQQ合成存在多种调控机制，不同甲基营养菌调控机制存在一定差异。为了研究甲基营养菌PQQ合成调控的一般规律，我们进行了新PQQ产生菌株的筛选。

通过甲醇营养培养基富集、NBT染色和Na⁃tive-PAGE筛选，我们获得了1株新的PQQ产生菌，经16S rDNA序列鉴定，初步确定该菌为生丝微菌。与文献报道的生丝微菌相比，该菌生长较缓慢，经过实验筛选，找到了一种较适宜该菌生长的培养基。我们初步发现该菌PQQ产生条件与本实验室现有的食甲基杆菌MP688存在明显差异，这为我们研究PQQ合成调控的共性和特性提供了新的生物材料。