miR-19a-3p通过靶向PIK3CB参与调控雌激素受体阳性乳腺癌化疗耐药的相关研究

高洁，李晨曦，赵辉，康欢荣，杜楠

解放军总医院第一附属医院 肿瘤二科，北京 100048

化学药物治疗（化疗）是目前治疗恶性肿瘤的主要手段之一[1-2]，而化疗耐受是制约临床肿瘤治疗效果的关键因素[3]。耐药机制包括药物吸收降低或排除增多、药物靶点改变、细胞修复功能增强等，关键基因的突变也可能导致耐药的发生。microRNA（miRNA）作为高度保守的非编码RNA，参与一系列重要的生命过程[4]。已有研究表明miRNA参与调控肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[1,5]。

多种化疗药物对乳腺癌有效，但很快会出现耐药。已有研究证实miRNA的异常可能与乳腺癌耐药有关[9-10]。miRNA可通过参与药物转运和代谢来调控肿瘤耐药。Chen等发现miRNA-200c过表达可降低靶标基因MDR1的表达和P-糖蛋白的表达，从而增强阿霉素治疗的敏感性[11]。miRNA可通过参与调控细胞活动相关的蛋白表达促进肿瘤细胞发生耐药。Liang等发现上调miR-19可参与乳腺癌细胞对紫杉醇、VP-16等药物的耐药，是通过抑制PTEN表达阻止细胞凋亡实现的[12]。miRNA可通过参与上皮间质转换（epi⁃thelial-mesenchymal transition，EMT）的发生调控肿瘤耐药。Cochrane等发现miRNA-200c通过抑制靶基因ZEB1的表达进而抑制E钙粘蛋白的表达，促进乳腺癌细胞EMT发生，促进肿瘤对顺铂和紫杉醇发生耐药[13]。以上研究结果表明miRNA与乳腺癌的化疗耐药密切相关，然而其作用机制仍然不清晰，对其进行深入探究或可改善化疗耐药，提高肿瘤治疗的药物敏感度，也一直是乳腺癌化疗耐药的研究热点。

我们发现雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性乳腺癌顺铂耐药的细胞株中miR-19a-3p显著低表达，推测miR-19a-3p在该过程中可能发挥重要作用。本研究探讨了miR-19a-3p在ER阳性乳腺癌化疗耐药中的作用及可能的调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料

ER阳性乳腺癌顺铂敏感细胞株MCF7-CTRL和耐药细胞株MCF7-RE为军事医学研究院国家生物医学分析中心免疫学研究室惠赠，正常传代培养；PIK3CB表达质粒pCMV6-PIK3CB购自北京傲锐东源生物科技有限公司；RPMI1640培养基、胎牛血清（FBS）、胰酶购自Gibco公司；miScriptⅡRT Kit、miScript SYBR Green PCR Kit购自 QIA⁃GEN公司；RNA寡核苷酸miRNA类似物和抑制物购自上海吉凯基因化学技术有限公司；转染试剂LipofectAMINE 2000、总RNA抽提试剂TRIzol购自Invitrogen公司。

1.2 MTT实验检测细胞活性

收集处于对数生长期的细胞于96孔板中，每孔接种约5×103细胞，每组设置3个复孔，37℃、5% CO2培养箱中培养24 h，用10 μmol/L顺铂分别处理ER阳性乳腺癌细胞敏感株和耐药株48 h，之后每孔加入15 μL MTT试剂（5 mg/mL），在培养箱中培养3 h，弃去培养基，加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），轻轻振荡混匀约10 min至结晶充分溶解，用酶标仪测定每孔的D490nm值，进行数据处理。

1.3 细胞总RNA提取

收取转染48 h后的细胞，用1×PBS缓冲液漂洗3次，加入1 mL TRIzol试剂室温裂解至细胞裂解液变得透亮；加入200 μL氯仿，剧烈振荡10 s，室温静置 5 min；4℃、12 000 r/min离心 15 min；小心吸取上层水相移至新管，加500 μL异丙醇，颠倒混匀后室温静置30 min；4℃、12 000 r/min离心15 min，管底白色沉淀即为总RNA；弃掉上清，加入1 mL 80% 乙醇，上下颠倒混匀；4℃、10 000 r/min离心15 min；弃上清后室温晾干，用DEPC水溶解沉淀；取适量RNA样品稀释后，用紫外分光光度计测定浓度，读取D260nm/D280nm值测定纯度，电泳鉴定RNA的完整性。

1.4 小RNA文库（sRNA）构建及测序

用15% 的PAGE胶分离不同大小片段的RNA，回收18～30 nt的片段，在T4RNA连接酶作用下加5′和3′测序接头将产物反转录为双链并扩增，用PAGE胶对PCR扩增产物切胶回收及纯化，回收产物溶于EB溶液中，完成文库建立。用Agi⁃lent2100 Bioanalyzer和Step One PlusReal-Time PCR System对构建的sRNA文库进行质量及产量评估，用IllumimaHiSeq 2500测序仪完成sRNA文库测序。

1.5 测序数据分析IlluminaHiSeq

IlluminaHiSeq 2500测序得到长度为49 nt的序列，通过数据处理去除3′端缺失、5′端污染、插入片段缺失、含polyA等序列后获得高质量的clean reads。对clean reads的长度、质量和分布等进行统计、分类和注释；通过bowtie将sRNA定位到基因组，分析reads在基因组上的分布及表达情况；用bowtie将reads与miRBase数据库进行比对，注释已知miRNAs；通过bowtie将sRNA和Gen⁃Bank、Rfam数据库比对，注释除miRNA以外的sRNA。

1.6 差异表达miRNA分析

筛选乳腺癌耐药细胞株和敏感株的文库差异表达miRNA，将2个文库中的miRNA归一化处理后进行倍数变化值（fold change）和P值统计计算。筛选显著性差异表达miRNA的具体标准为：①reads数大于 10；②∣log2（fold change）∣＞1；③P＜0.05。

1.7 实时荧光定量PCR

用miScript SYBR Green PCR Kit检测试剂盒分析miRNA的相对含量。按说明书步骤，采用2 μg总RNA进行反转录，qPCR检测。U6作为内参，通过CT（2-ΔΔCt）方法分析miRNA的相对含量。

1.8 miRNA类似物/抑制物及质粒转染

每孔取20 pmol miRNA类似物/抑制物，稀释于250 μL无血清1640培养基中；按照样品与转染试剂为1∶3的比例将LipofectAMINE 2000转染试剂稀释于250 μL无血清1640培养基中，轻弹混匀，室温静置5 min后加入载体稀释物中，轻弹混匀，室温静置20 min；将样品-转染试剂混合物逐滴加入细胞培养板中，同时设置对照组，转染后48 h提取总RNA。质粒转染操作类似，用量为1 μg/孔（24孔板）。

1.9 Starbase数据调取

选择Starbase v2.0数据库（http://starbase.sysu.edu.cn/）中 miRNA-target interaction 板块 miRNA-mRNA模块，分析miR-19a-3p的靶基因。

1.10 统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理，计量资料用x±s表示，组间数据比较采用t检验分析和方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 顺铂处理对ER阳性乳腺癌细胞活性的影响

10 μmol/L顺铂处理ER阳性乳腺癌耐药细胞株和敏感株MCF7，MTT检测细胞活性，结果如图1所示，耐药株的细胞数量随着处理时间的增加与敏感株相比逐渐增多（P＜0.001）。结果说明乳腺癌耐药细胞株对顺铂处理不敏感。

图1 顺铂处理对ER阳性乳腺癌细胞活性的影响

2.2 筛选差异表达miRNA

RNA测序筛选ER阳性乳腺癌耐药细胞株和敏感株差异表达的miRNA（图2），发现miR-19a-3p在耐药株MCF7-CTRL和敏感株MCF7-RE中的表达差异最大，在耐药株MCF7-RE中呈低表达。

图2 RNA测序筛选差异表达基因

2.3 ER阳性乳腺癌耐药细胞株和敏感株miR-19a-3p的表达

实时荧光定量PCR检测ER阳性乳腺癌耐药株MCF7-RE和敏感株MCF7-CTRL中miR-19a-3p的含量，结果见图3，miR-19a-3p在耐药细胞株中的含量远低于敏感株（**P＜0.01）。该结果进一步验证了RNA测序的筛选结果。

图3 miR-19a-3p在ER阳性乳腺癌耐药细胞株和敏感株中的表达量

2.4 miR-19a-3p过表达降低ER阳性乳腺癌耐药株化疗耐药

合成miR-19a-3p类似物和抑制物，分别转染MCF7-RE和MCF7-CTRL（图4A）。miR-19a-3p过表达可比较明显地降低乳腺癌耐药细胞株的耐药浓度，增加对顺铂药物的敏感度；同时，在敏感株中抑制miR-19a-3p的表达也反过来增加了敏感细胞株的药物作用浓度（图4B，P＜0.01）。该结果提示，miR-19a-3p负调控ER阳性乳腺癌细胞顺铂耐药。

图4 miR-19a-3p影响ER阳性乳腺癌细胞的耐药药物浓度

2.5 miR-19a-3p负调控PIK3CB参与乳腺癌化疗耐药

我们对miR-19a-3p参与调控乳腺癌细胞顺铂敏感的作用机制进行了初步研究。通过Star⁃basev 2.0分析发现，在229例乳腺癌样本中，癌基因PIK3CB（PI3K）是miR-19a-3p调控的靶标基因，并且呈负相关（图5A，r=-0.125 75）。PIK3CB是PI3K/Akt信号通路的重要组成成分之一，在肿瘤形成和发展过程中发挥重要作用，如抑制细胞凋亡、促进细胞增殖等。分别转染miR-19a-3p类似物和抑制物，通过实时荧光定量PCR和Western印迹分别在RNA和蛋白表达水平进行了验证，结果显示miR-19a-3p能够负调控PIK3CB（图5B）。在乳腺癌耐药细胞株中，转染miR-19a-3p能够明显降低细胞的耐药性，抑制其增殖；如果同时转染PIK3CB表达质粒进行回复实验，会部分减弱miR-19a-3p耐药抑制的效应（图6）。

图5 miR-19a-3p在乳腺癌细胞中靶向调控癌基因PIK3CB

图6 miR-19a-3p负调控癌基因PIK3CB参与乳腺癌细胞化疗耐药

3 讨论

目前乳腺癌的治疗方式是以手术、内分泌治疗[6]、化疗和靶向治疗等多种手段结合的综合治疗[1]。研究表明，约70% 的乳腺癌患者会出现化疗耐药或在接受治疗后很快出现化疗耐药[7-8]。无论是初始耐药还是获得性耐药，都会影响乳腺癌患者的生活状态和生存时间。

然而截至目前化疗耐药的机制并不十分清楚。大量研究表明，miRNA在肿瘤发生发展中可通过多种途径发挥促癌或抑癌作用，这其中一些病理、生理过程与肿瘤化疗耐药密切相关，可见miRNA也参与肿瘤化疗耐药的发生[2]。

我们通过RNA测序发现，在化疗耐药的ER阳性乳腺癌细胞耐药株和敏感株中，miR-19a-3p的含量差异显著。通过qPCR对ER阳性乳腺癌耐药株和敏感株进行检测，证实miR-19a-3p在耐药株中低表达。进而初步分析miR-19a-3p负调控乳腺癌化疗耐药的机制，通过Starbase v2.0调取TCGA数据库中miR-19a-3p的相关数据，预测癌基因PIK3CB是miR-19a-3p的靶标基因并呈负相关，后续我们证明miR-19a-3p的确能够靶向PIK3CB并与乳腺癌细胞的顺铂耐药相关。在回复实验过程中，过表达PIK3CB能够部分抵消miR-19a-3p的耐药抑制性，一方面说明miR-19a-3b/PIK3CB调控耐药性的通路的确存在，另一方面说明存在miR-19a-3p靶向其他潜在靶标参与耐药调控的可能性。由于miRNA作用靶标众多，具有多能性，我们后续的工作须扩大筛选范围，尽可能探索与描绘miR-19a-3p在乳腺癌中的功能性调控网络，而不是局限于对PIK3CB的调控研究，这将有助于深入解析miR-19a-3p调控ER阳性乳腺癌化疗耐药的机制，为临床预防或治疗ER阳性乳腺癌提供新的靶点。