犬细小病毒可视化LAMP检测方法的建立

廖翔，何景龙，李洪波

北京美莱博医学科技有限公司，北京 100071

犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）属于细小病毒科，于1978年分离自患肠炎的犬类粪便。CPV感染会引起犬细小病毒肠炎，是全球范围流行的犬类烈性传染病之一[1]，同时也是包括大熊猫在内的珍稀濒危动物的主要烈性传染病。其病程短、传染性强、死亡率高，对犬类危害很大，需要有快速准确的检测方法，以便及时治疗。

目前CPV的快速检测方法主要有基于血清蛋白的免疫性检测[2]和针对病毒DNA的基因检测。基因检测包括常规PCR扩增和荧光定量PCR检测[3]，以及近几年发展较快的环介导等温扩增（loopmediated isothermal amplification,LAMP）[4-7]。

LAMP[8]是Notomi等发明的一种恒温扩增方法，其特点是降低了对仪器的要求，只需要一个水浴锅等恒温设施即可反应。然而，常规LAMP仍需要专门的检测设备，不便现场检测。

根据DNA聚合酶在扩增过程中每延伸一个碱基会释放一个氢离子，从而使溶液pH值逐渐降低的原理，我们建立了一种pH敏感指示剂中性红检测犬细小病毒的LAMP方法。本方法只需恒温扩增仪器，即恒温水浴或金属浴，不需要检测仪器，40 min完成LAMP，阴性反应保持初始淡黄色状态，阳性扩增反应液则会变为紫红色，肉眼即可分辨阳性扩增和阴性反应，非常方便现场快速病毒检测。

1 材料和方法

1.1 材料

犬细小病毒DNA样品由军事医学研究院军事兽医研究所惠赠；金黄色葡萄球菌、宋内志贺菌、坂崎肠杆菌、单增李斯特菌、大肠杆菌的DNA由浙江省质量检测科学研究院惠赠；标准质粒pUC-CPV由上海捷瑞公司合成；1×RM LAMP（含Eva Green）反应液、可视化1×RM LAMP（含中性红）反应液和2×PCR TaqMix由北京美莱博医学科技有限公司生产；DL2000 DNA marker为广州东盛生物科技有限公司产品；Bst2.0 DNA聚合酶购自NEB公司；荧光定量PCR仪为Roche公司的LightCycler 480II。

1.2 引物设计和合成

采用Primer Premier 5.0程序设计LAMP引物CPV-F3（5′-TGGGATAAAGAATTTGATACTGA-3′）、CPV-B3（5′-TGAGAGGCTCTTAGTTTAGCTTT-3′）、CPV-FIP（5′-CGCAACTTTTACAAATAATTGACCATT AAAACCAAGACTTCATGTAAATGC-3′）、CPV-BIP（5′-AACAAATGAATATGATCCTGATGCAACCTTTCC ACCAAAAATCTGAGT-3′）、CPV-FLP（5′-GGACAAT TATTTTGACAAACAAATGG-3′）、CPV-BLP（5′-TCT GCTAATATGTCAAGAATTGTAAC-3′），由上海捷瑞公司合成。

国标犬细小病毒病诊断技术[9]上游引物为CPVF（5′-GAATCTGCTACTCAGCCACCAAC-3′），下游引物为 CPVR（5′-GTGCACTATAACCAACCTCAGC-3′），由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

用纯水将所有引物溶解为100 μmol/L浓度的母液，然后配制LAMP用引物混合物CPV-PM，含 CPV-FIP、CPV-BIP 各 32 μmol/L，CPV-FLP、CPV-BLP、CPV-F3和 CPV-B3各 4 μmol/L。每20 μL LAMP 反应体系加入1 μL CPV-PM。国标引物根据国标要求配制。

1.3 标准质粒的制备

捷瑞公司合成并提供的pUC-CPV质粒为5 μg干粉，用50 μL纯水溶解，浓度为100 ng/μL。质粒大小为3200 bp，其相对分子质量计算为3200×660=2.1×106。根据公式［质粒拷贝数=（质量浓度÷分子量）×6.02×1023］计算拷贝数，将质粒稀释至1×103、1×102、1×101拷贝/μL作为扩增反应的阳性对照标准品。

1.4 实时荧光定量LAMP

每 17 μL 1×RM LAMP 反应液中加入 1 μLBst2.0 DNA聚合酶、1 μL CPV-PM、1 μL pUC-CPV标准质粒，混匀后加入384孔板，盖上透明封口膜，置LightCycler 480II中进行LAMP反应和高分辨熔解曲线（HRM）分析。检测模式为SYBR Green I/HRM Dye，LAMP条件为65℃恒温反应60 min，每20 s检测1次荧光值；扩增后直接进行HRM分析，温度范围60～95℃，分辨率为每摄氏度读取荧光5次。

1.5 可视化LAMP检测方法

每17 μL可视化LAMP 1×RM反应液中加入1 μLBst2.0 DNA 聚合酶、1 μL CPV-PM、1 μL pUC-CPV标准质粒，混匀后于65℃恒温烘箱中反应40 min，肉眼观察扩增结果，拍照记录。

1.6 病毒样本检测和测序验证

分别用可视化LAMP和实时荧光定量LAMP检测犬细小病毒DNA样品。对于检测为阳性的样品，用引物CPV-F3和CPV-B3进行普通PCR扩增，委托测序公司对扩增产物进行测序验证。

1.7 国标方法检测病毒样本

用国标犬细小病毒检测技术[9]检测犬细小病毒的DNA，PCR完成后进行电泳，并拍照记录。

1.8 可视化LAMP检测方法特异性试验

用本研究建立的可视化LAMP方法对犬细小病毒阳性DNA及金黄色葡萄球菌、宋内志贺菌、坂崎肠杆菌、单增李斯特菌、大肠杆菌的DNA进行特异性检测，并将反应结果拍照记录。

报警装置采用模块化设计,包括声光报警单元、电量检测模块、充电保护模块、RF433射频模块、GPRS通信模块、北斗/GPS定位模块、电池模块和MSP430单片机模块。声光报警单元主要用于本地报警和状态指示;电量检测模块对报警装置的电池电量进行检测;充电保护模块用于为电池充电,具有过充保护;RF433射频模块用于检测装置与报警装置的无线通信;GPRS通信模块用于报警装置与后台服务器的数据通信;北斗/GPS定位模块用于获取报警装置的位置数据;电池模块用于为报警装置提供电能。报警装置安装有锂电池,同时能够进行外部供电,其电池能够保证报警装置断电后工作6 h。

2 结果

2.1 犬细小病毒检测靶序列的确定

通过77个不同犬细小病毒全基因组的数据比对，从中找出一段433 bp的高度保守序列：

2.2 实时荧光定量LAMP的灵敏度

为避免LAMP后进行电泳容易导致的气溶胶污染问题及离心看沉淀容易导致的误判问题，特采用实时荧光定量PCR仪配合荧光染料Eva Green进行实时定量LAMP和高分辨率熔解曲线分析。以1/10梯度稀释的质粒标准品和水作为模板，进行实时荧光定量犬细小病毒LAMP检测。

用1×103、1×102、1×101拷贝/μL模板和空白对照进行扩增。从图1可见，3个加水的空白对照孔无扩增信号，1×103～1×101拷贝/μL 模板进入对数期的时间在15 min以内，而且反应时间随模板浓度降低依次递增，符合模板浓度与扩增速度的对应规律。犬细小病毒LAMP检测灵敏度低至101拷贝/μL的质粒标准品。图2的HRM分析结果表明 LAMP 反应的特异性很好，1×103～1×101拷贝/μL模板扩增产物的Tm值都在同一个温度区间，说明产物完全一致。

图1 实时荧光定量LAMP检测犬细小病毒质粒标准品的扩增曲线

2.3 可视化LAMP扩增的灵敏度

用pH敏感指示剂中性红检测LAMP，中性红在扩增反应前pH8.0左右的反应液中呈淡黄色，而LAMP后反应液的pH值会下降到7.6以下，此时中性红变为淡紫红色。

用1×103、1×102、1×101拷贝/μL模板和空白对照进行扩增。从图3可见，反应40 min时，3个浓度模板的扩增反应液均变成了淡紫红色，而空白对照反应仍为淡黄色。可视化LAMP扩增灵敏度和实时荧光定量LAMP扩增灵敏度相同。

图2 实时荧光定量LAMP检测犬细小病毒质粒标准品的熔解曲线

2.4 可视化LAMP检测方法的特异性

因犬细小病毒为DNA病毒，与RNA病毒的反应体系差异较大，故特异性实验选用了金黄色葡萄球菌、宋内志贺菌、坂崎肠杆菌、单增李斯特菌、大肠杆菌的DNA作为对照样品。图4可见，只有犬细小病毒发生了颜色变化，而其他DNA及水没有扩增信号，说明本检测方法特异性强。

2.5 病毒样本检测和测序验证

用实时荧光定量LAMP和建立的可视化LAMP法检测了50份疑似犬细小病毒DNA样品。荧光检测染料扩增结果（图5）表明其中35份样品为犬细小病毒阳性，与图6可视化检测结果一致；HRM分析结果（图7）表明阳性样品的扩增产物Tm值一致，且和图2质粒扩增Tm值一致,说明反应产物相同。

图3 可视化LAMP检测犬细小病毒标准质粒

图8 为用国标法检测50个样品DNA的电泳图，扩增长度为609 bp，检测结果同可视化检测与荧光检测完全一致。用引物CPV-F3和CPVB3进行普通PCR扩增，委托北京天一辉远生物科技有限公司测序（图9），并对扩增产物进行比对验证，结果表明阳性样品含有犬细小病毒DNA序列，且15个LAMP检测阴性样品不含犬细小病毒序列，表明本方法和国标检测的符合度为100% 。

图4 可视化LAMP检测犬细小病毒方法特异性试验

图5 实时荧光定量LAMP检测疑似犬细小病毒扩增曲线

图6 疑似犬细小病毒DNA的可视化LAMP检测

图7 疑似犬细小病毒样品DNA的实时荧光定量LAMP熔解曲线

图8 疑似犬细小病毒样品DNA的国标检测结果

图9 犬细小病毒可视化LAMP检测阳性DNA样品PCR产物测序图谱

3 讨论

我们建立了一种高效、准确且方便的犬细小病毒检测方法。该方法不需要昂贵复杂的仪器，一个金属浴或水浴锅即可进行反应；判断结果不需要任何仪器，肉眼即可判断阴性和阳性样品。

pH值在扩增前后的变化是本可视化检测的基础，因此本方法采用的扩增体系是非缓冲体系，而非缓冲体系对引物的要求较高。我们共设计了6套扩增引物，结果3套没有扩增信号，2套引物的扩增效率低。扩增超过80 min时，阴性对照也会出现颜色变化而影响对实验结果的判断，所以广泛筛选引物是实验成功与否的关键。我们同时应用了溴百里香酚蓝和甲酚红作为pH指示剂，均因颜色变化不明显而放弃。

我们建立的方法操作简单，无须专业训练即可使用；扩增后无须开盖，肉眼便可判定检测结果，从而避免了产物污染的问题。本方法可用于虎与大熊猫的野外或基层犬细小病毒检测，也可以用于宠物猫与狗的家庭化犬细小病毒检测。用本方法可以开发多种细菌和病毒的检测试剂盒，可有效提高对传染病的防控能力。