孕期母体镉暴露对C57BL/6小鼠肝脏和肾脏的组织特异性氧化损伤作用

郭慧琴，吴中强，毛秀丽，王欢，王兰，许鹏,2

1.山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006；2.上海交通大学 Bio-X研究院，上海 200030

镉是当今重金属污染中涉及面积最广、危害最大的重金属元素之一[1]。镉主要通过食物摄取、吸烟等方式进入人体，并且随血液流动而在体内多种器官中积累并产生毒性效应。其中，镉的生殖毒性近年来已成为研究热点。研究显示，镉一方面可以抑制正常育龄男女的配子发生；另一方面可能会导致多种不良妊娠结局，如早产、胎儿生长受限等[2-3]。

胎儿生长受限与多种因素（母体因素、胎盘因素和胎儿因素）相关[4]。一系列流行病学调查结果和体内实验结果显示，胎盘可能是镉诱发胎儿生长受限的毒性作用的主要靶器官之一[5-6]。我们的前期研究显示，孕期母体镉暴露的小鼠肝脏和肾脏中的镉积累量远远高于胎盘[7]；并且，妊娠期母体肝脏和肾脏功能的异常有可能引起多种不良妊娠结局并对胎儿发育产生影响[8-10]。因此，对孕期镉暴露的母体肝脏和肾脏的研究，可能有助于进一步阐明孕期镉暴露致胎儿生长受限的毒性机制。目前，研究者普遍认为，由自由基介导的生物体内的氧化损伤是镉毒性效应的主要体现。鉴于此，本研究利用课题组前期建立的孕期镉暴露致胎儿生长受限小鼠模型，分别检测镉暴露小鼠肝脏和肾脏组织中抗氧化酶［超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）］活性、脂质过氧化水平（MDA含量）、蛋白质羰基化（PCO含量）水平和DNA-蛋白质交联（DPC）的变化情况，旨在特异性检测孕期镉暴露对母体肝脏和肾脏的氧化损伤程度，从而为揭示孕期母体镉暴露致胎儿生长受限作用的分子调控机理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

性成熟的8周龄C57BL/6小鼠（雄性小鼠体重25～28 g，雌性小鼠体重：0～23 g）购自北京生命河实验动物中心。

氯化镉（CdCl2·2.5H2O）（分析纯，天津博迪化工有限公司）实验前用蒸馏水配成20 000 mg/L的母液；标准镉溶液（1000 mg/L，国家环境保护总局标准样品研究所）；SOD、CAT、GPx、丙二醛（MDA）含量和总蛋白含量试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Tris、蛋白酶K和荧光染料Hoechest33258（Sigma公司）；盐酸胍和EDTA（分析纯，北京化工厂）；2，4-二硝基苯肼（DNPH）（分析纯，天津Kermal化学试剂开发中心）。

1.2 实验设计

C57BL/6小鼠严格按照中国辐射防护研究院动物伦理委员会制订的实验动物操作相关规范，在中国辐射防护研究院实验动物中心进行小鼠的日常饲养和管理，饲养温度为（23±1）℃，湿度为（60±5）% ，光照周期12 h/12 h，自由采食饮水，适应环境1周后开始进行合笼操作。合笼操作每天晚上9点开始（每笼中放置1只雄鼠与2～3只雌鼠），次日早晨7点检查阴栓，以出现阴栓的当天作为妊娠第0.5 d（Embryonic 0.5，E0.5）。自E7.5开始，将45只体重相近的孕鼠分为3组，分别喂食0、20和40 mg/L氯化镉（CdCl2）溶液。喂食的CdCl2溶液每天更换，并且用原子吸收仪对相关溶液进行检测以确保浓度恒定。分别于E13.5、E16.5和E19.5收集各组小鼠的胎儿、胎盘、肝脏等组织标本，每一妊娠阶段5只动物。通过比较各组小鼠在不同妊娠时期的胎儿数量、胎儿胎盘重量，确认孕期镉暴露致胎儿生长受限动物模型建立成功。所有材料收集后立即置于液氮内冻存，以备后续实验取用。

1.3 样品制备及生理生化指标测定

将孕鼠的肝脏、肾脏组织按组织质量体积比（1 g/4 mL）加入磷酸缓冲液（PBS，pH7.4），电动匀浆器制备20% 的组织匀浆液，4℃、2500 r/min离心 10 min，取上清备用。SOD、CAT、GPx活性、MDA含量和蛋白含量采用试剂盒测定；PCO和DPC测定方法参见文献[11]。

1.4 数据处理

所有实验数据均采用SPSS 16.0软件单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行统计分析，结果用x±SD表示，P＜0.05表示存在显著性差异，P＜0.01表示存在极显著性差异。

2 结果

本课题组的前期研究表明，孕期母体镉暴露会导致妊娠末期（E19.5）胎儿重量显著性降低[7]，因此本研究仅对E16.5和E19.5的小鼠肝脏和肾脏样本进行检测。

2.1 孕期母体镉暴露对小鼠肝脏和肾脏组织抗氧化酶活性的影响

2.1.1 孕期母体镉暴露对小鼠肝脏和肾脏组织SOD活性的影响 由图1A、B可见，所有镉处理组小鼠肝脏、肾脏组织中的SOD活性均高于对照组。E19.5时，40 mg/L镉处理组小鼠肝脏组织中的SOD活性显著性升高，而肾脏中的SOD活性无显著性变化。

2.1.2 孕期母体镉暴露对小鼠肝脏和肾脏组织CAT活性的影响 如图1C、D所示，所有镉处理组小鼠肝脏、肾脏组织中的CAT活性均高于对照组，表现出CAT活性随染毒浓度的增加而逐渐升高，并随染毒时间的延长而逐渐降低。E19.5时，20和40 mg/L镉处理组小鼠肾脏组织的CAT活性呈显著性或极显著性升高；40 mg/L镉处理组的肝脏组织CAT活性呈显著性升高，而20 mg/L镉处理组的肝脏组织CAT活性则无显著性变化。

2.1.3 孕期母体镉暴露对小鼠肝脏和肾脏组织GPx活性的影响 由图1E、F可知，所有镉处理组小鼠肝脏、肾脏组织中的GPx活性均高于对照组，GPx活性在小鼠肝脏组织中随时间延长而逐渐降低，而在小鼠肾脏组织中随时间延长而逐渐升高。在E19.5，20和40 mg/L镉处理组小鼠肝脏和肾脏组织的GPx活性均表现为极显著性增高。

图1 孕期母体镉暴露对小鼠肝脏（A、C和E）和肾脏（B、D和F）抗氧化酶活性的影响（n=5）

2.2 孕期母体镉暴露对小鼠肝脏和肾脏组织MDA含量的影响

所有镉处理组小鼠肝脏和肾脏组织中的MDA含量均高于对照组。在小鼠肝脏组织中，MDA含量随镉染毒浓度的增加而逐渐升高，随时间延长而逐渐降低。20、40 mg/L镉处理组小鼠肝脏的MDA含量在E16.5和E19.5时均呈显著性或极显著性升高；而20、40 mg/L镉处理组小鼠肾脏的MDA含量仅在E19.5时呈极显著性升高，而在E16.5时无显著性变化（图2A、B）。

图2 孕期母体镉暴露对小鼠肝脏（A）和肾脏（B）中MDA含量的影响（n=5）

2.3 孕期母体镉暴露对小鼠肝脏和肾脏组织PCO含量的影响

图3A、B显示，所有镉处理组小鼠肝脏、肾脏组织中的PCO含量均高于对照组，且随镉浓度增加而逐渐升高。E19.5时，20、40 mg/L镉处理组小鼠肝脏和肾脏的PCO含量均呈显著性或极显著性升高。E16.5时，20和40 mg/L镉处理组小鼠肾脏的PCO含量呈显著性升高，40 mg/L镉处理组小鼠肝脏的PCO含量呈显著性升高。

2.4 孕期母体镉暴露对小鼠肝脏和肾脏组织DPC的影响

图4A、B表明，所有镉处理组小鼠肝脏、肾脏组织中的DPC均高于对照组，表现出DPC随染毒浓度和暴露时间的延长逐渐升高。E16.5时，40 mg/L镉处理组小鼠肝脏和肾脏DPC与正常组相比，显著升高；E19.5时，20、40 mg/L镉处理组小鼠肝脏和肾脏的DPC与正常组相比，显著升高。

图3 孕期母体镉暴露对小鼠肝脏（A）和肾脏（B）中PCO含量的影响（n=5）

图4 孕期母体镉暴露对小鼠肝脏（A）和肾脏（B）中DPC水平的影响（n=5）

3 讨论

3.1 肝脏和肾脏可能是镉诱发胎儿生长受限的毒性作用的主要靶器官

胎儿生长受限是围产期常见的并发症之一，在我国发病率约为6.39%[12]。该疾病不仅增加围产期胎儿、婴幼儿的发病率和死亡率，限制儿童期、青春期的体格和智能发育，还可能是成年期Ⅱ型糖尿病、肥胖症、高血压、冠心病及精神分裂症等慢性疾病高发的重要诱因[12-13]。镉是诱发胎儿生长受限的一类重要环境因素[2]，近年来，镉致胎儿生长受限的毒性机制受到研究者的广泛关注。然而，这些研究大都着眼于镉在胎盘中的积累及其引起的胎盘病理性变化[5-6,14]，对其他因素的研究相对较少，如胎儿因素和母体因素。

母体因素也是胎儿生长受限的一类重要因素，妊娠期的各种并发症（如妊娠高血压）、母体的营养不良（如蛋白质和能量供应不足）都会对胎儿的生长发育产生影响[4]。肝脏和肾脏是母体的两类重要代谢器官。妊娠期新陈代谢旺盛和雌激素分泌增多会加重肝脏和肾脏负担，并导致其结构和功能发生很大的改变。更重要的是，患有肝病和肾病的孕妇在妊娠晚期时，容易发生一系列的肝脏和肾脏的病理性变化，产生多种不良妊娠结局（如产后出血、流产），并导致母婴死亡率的提高[8-10,15-16]。巧合的是，我们前期研究发现，孕期母体镉暴露小鼠的肝脏和肾脏的镉积累量远远高于胎盘，并且在肝脏中的镉积累量约为肾脏的2倍[7]。因此，母体的肝脏、肾脏可能是镉诱发胎儿生长受限的毒性作用的主要靶器官，并且其毒性损伤效应也可能由于镉积累量的不同而呈现组织特异性的变化。

3.2 孕期母体镉暴露对小鼠肝脏、肾脏的氧化性损伤作用

镉的毒性效应已有近150年的研究历史，研究者也已经提出了多种分子机制来阐释其毒性机理，其中氧化损伤机制受到绝大多数研究者的认同[17]。氧化损伤主要表现为2种方式：直接诱导生物体内产生活性氧、自由基代谢物；间接降低生物体清除氧自由基的能力[18]。后者通过作用于体内的抗氧化系统来完成。SOD、CAT和GPx是机体抗氧化系统中的3种重要酶类，SOD可清除O2-，将其转化为H2O2；而CAT和GPX则可以将H2O2转化成H2O和O2[19]。

本研究结果显示，SOD活性变化较小，直到E19.5时，40 mg/L高浓度镉处理组小鼠肝脏组织的SOD活性才发生显著性升高。这可能是由于镉暴露浓度相对较低，暴露时间较短，使得机体内未产生较高水平的O2-，无法激活2种组织SOD活性发生变化。而SOD活性仅在肝脏，而不是肾脏中发生显著性变化，则可能是由于镉在肝脏中的积累量远远高于肾脏所致[7]。E19.5的CAT活性较E16.5表现为降低趋势，这与“促进-抑制”效应机制吻合，即低浓度镉暴露时,可使生物体内的抗氧化酶活性升高，出现“毒性兴奋效应”；而高浓度时,则通常会使生物体内的抗氧化酶活性受抑制而降低，生物体内活性氧过量积累，导致生物体损伤。与CAT活性表现不同的是，GPx活性在镉暴露的小鼠肝脏，而不是小鼠肾脏中表现出“促进-抑制”效应，这可能也是由于镉在肝脏和肾脏中的镉积累量的差异[7]。此外，同一时间，随着镉浓度的增加，CAT的活性仍然呈升高趋势，可能是因为镉浓度在40 mg/L时，在E19.5没有达到抑制CAT活性的程度，有利于MDA的清除。镉对小鼠肝脏、肾脏抗氧化系统的破坏降低了细胞对氧自由基的清除能力，间接导致小鼠肝脏、肾脏组织的损伤[20]。

3.3 孕期母体镉暴露对小鼠肝脏、肾脏的MDA、PCO含量和DPC的影响

镉在生物体内大量积累，机体会产生过多的自由基，当抗氧化系统不足以清除体内自由基时，就造成机体氧化损伤，产生脂质过氧化反应。MDA是脂质过氧化反应的产物，其含量可以反映机体氧化损伤程度[21]。此外，镉还能破坏核酸和蛋白质等生物大分子，对生物体产生毒性作用，因此，PCO含量和DPC水平也可以作为反映机体氧化损伤程度的指示物[22-23]。在本研究中，MDA、PCO含量和DPC水平均出现显著升高。其中PCO含量和DPC水平随镉浓度的升高和（或）染毒时间的延长呈升高趋势，这与前人的一些研究结果基本一致[24-27]。而在E19.5，小鼠肝脏的MDA含量相比于E16.5出现了降低的情况，可能与E16.5时小鼠肝脏的CAT活性仍然没有被抑制有关。同时，该现象在小鼠肝脏，而不是肾脏中出现则可能与镉在肝脏和肾脏中的镉积累量的差异相关[7]。综上所述，孕期母体镉暴露对母体肝脏和肾脏产生严重的氧化损伤，进而可能对胎儿生长发育产生影响，不同组织的氧化损伤程度具有差异。

3.4 结论

肝脏和肾脏可能是孕期镉暴露诱发胎儿生长受限的毒性作用的主要靶器官。

孕期镉暴露不但能诱导母体肝脏、肾脏的氧化应激水平的升高，而且进一步导致了母体肝脏、肾脏中脂质、蛋白质和DNA生物大分子的损伤，上述指标的变化情况可以为解释孕期母体镉暴露致胎儿生长受限的分子调控机理提供科学依据。

孕期镉暴露诱导的母体肝脏和肾脏的氧化损伤指标的变化具有组织特异性，这可能与镉在母体肝脏和肾脏中的积累量不同有关。