人铜锌超氧化物歧化酶在大肠杆菌中的融合表达与纯化

刘晓阳，刘凌志，李彤，汪建华，张惟材，田威，熊向华

1.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016；2.军事科学院 军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100071

好氧生物体在代谢过程中，体内会持续产生一系列活性氧（reactive oxygen species，ROS），如超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢等。活性氧可以影响DNA、脂质、蛋白质等生物大分子的调节，其过度累积会引起DNA损伤，抑制细胞内酶的活性，甚至导致细胞死亡[1-3]。为应对活性氧导致的氧化损伤并维持机体氧化还原稳态，好氧生物体发展出了高效的抗氧化酶保护系统[4]。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是重要的抗氧化酶，能够将胞外、胞质和线粒体基质中的超氧阴离子自由基降解为过氧化氢和氧气[5]。依照其在细胞中的作用位置，可将SOD分为3种，即定位于细胞质的SOD1、定位于线粒体的SOD2和定位于细胞外的SOD3。其中，SOD1占SOD总量的90%[6]，是稳定性最高的SOD[4]，广泛分布于真核生物中。SOD1发挥生物活性时需要依赖铜离子和锌离子[7]，故也被称为铜锌超氧化物歧化酶。SOD1的异常可以引起好氧生物体各种不良症状。Muller等研究发现，缺乏SOD1的小鼠会出现肌肉量流失、白内障、黄斑变性、胸腺退化的症状，甚至寿命缩短[8]；人家族性肌萎缩性侧索硬化症也与SOD1基因突变相关，且SOD1基因的单一突变就足以引发该疾病，其中涉及的确切分子机制尚不清楚[9-11]。SOD1已经应用于药物、化妆品领域，因此在体外获取大量具有活性的SOD1具有重要意义。我们利用麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein，MBP）融合表达的方式，经亲和层析、蛋白酶切和分子筛层析纯化获得了有活性的人铜锌超氧化物歧化酶（HuSOD1），为HuSOD1的机制和应用研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌感受态细胞 DH5α、BL21（DE3）购自北京天根生化科技有限公司；pMAL-p5x质粒由本实验室保存；HuSOD1基因由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自康为世纪生物试剂有限公司；质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；因子Ⅹa、T4DNA连接酶购自NEB公司；限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ、DNA凝胶回收试剂盒、抗鼠单抗羊抗体购自Thermo公司；HuSOD1鼠单克隆抗体购自北京义翘神州科技有限公司；超滤离心管购自Millipore公司；MBP鼠单克隆抗体购自Proteintech公司；Eazysee Western印迹试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司；MBP预装柱购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.2 HuSOD1表达载体的构建

根据GenBank公布的HuSOD1基因序列（序列号EF151142），由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成HuSOD1基因；以合成基因为模板，采用上游引物（5′-CCCATATGGCGACGAAGGCCG-3′）和下 游 引 物（5′-CGGAATTCTTATTGGGCGATCCCA ATTACAC-3′），PCR扩增目的基因（反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30℃，30个循环；72℃终延伸10 min）；扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳分析，切取目的基因，用胶回收试剂盒回收；目的基因和pMAL-p5x质粒分别用NdeⅠ、EcoRⅠ于37℃双酶切3 h，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，活化后涂布于含氨苄西林（Amp）的LB固体培养基，37℃培养过夜；挑取单菌落至LB（含Amp）液体培养基中，培养后进行菌液PCR鉴定，选取阳性克隆送华大公司测序。

1.3 MBP-HuSOD1融合蛋白的诱导表达及活性检测

将重组质粒pMAL-p5x-HuSOD1、载体pMAL-p5x分别转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，活化后涂布于含Amp的LB固体培养基，37℃培养过夜；挑取单菌落于含Amp的LB液体培养基，37℃、200 r/min培养过夜；取50 μL菌液于5 mL LB（含Amp）液体培养基中，培养至菌液D600nm约为1.0时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，37℃诱导表达3 h；取1 mL诱导后的菌液，12 000 r/min离心收集菌体，用500 μL TE裂解液重悬后超声波裂解；分别取全菌裂解液、裂解液上清、裂解液沉淀，加入6×SDS上样缓冲液，煮沸8 min后进行12.5% 的SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色1 h，脱色液脱色过夜，经凝胶扫描后分析蛋白表达水平和形式；取超声波裂解液稀释至1/20，以转化空质粒的裂解液为对照，采用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法[12]测定SOD活力。

1.4 MBP-HuSOD1融合蛋白的纯化

将活化的菌液以1% 的比例扩大培养于200 mL含Amp的LB液体培养基中，12 000 r/min离心收集菌体，用10 mL PBS缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体30 min，12 000 r/min离心10 min，收集上清，用麦芽糖结合预装柱纯化。经结合缓冲液（含 20 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA，pH7.4）漂洗去除杂蛋白直至洗平基线并收集穿过液，通过洗脱缓冲液（含20 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L 麦芽糖、1 mmol/L EDTA，pH7.4）洗脱并收集目的蛋白。

1.5 MBP-HuSOD1融合蛋白酶切与HuSOD1纯化

选用截留相对分子质量为10×103的超滤离心管将MBP-HuSOD1融合蛋白浓缩至1 mg/mL（采用BCA法测定目的蛋白浓度），100 μL目的蛋白用5 μL因子Ⅹa于25℃酶切，分别在酶切2、4、8、24 h 时从体系中取出 5 μL，加入 5 μL 2×蛋白上样缓冲液，SDS-PAGE分析。用分子筛层析分离因子Ⅹa酶切产物，收集目的蛋白进行Western印迹。

2 结果

2.1 pMAL-p5x-HuSOD1表达载体的构建

PCR扩增HuSOD1基因，经凝胶电泳分析获得片段大小约为465 bp，与预期相符（图1A）。将目的片段与pMAL-p5x重组后转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，目的条带大小与阳性对照条带相同（图1B）。阳性转化子活化后送华大公司测序，测序结果与目的基因进行比对，显示基因序列一致（序列略），说明重组质粒pMAL-p5x-HuSOD1构建成功。

图1 HuSOD1基因扩增（A）及pMAL-p5x-HuSOD1重组载体的PCR鉴定（B）

2.2 MBP-HuSOD1融合蛋白的表达及活性检测

将构建的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取单菌落于37℃培养至适当菌密度时用IPTG诱导3 h，菌体超声波破碎后进行SDSPAGE分析，结果显示有特异性蛋白条带，该条带约占全菌蛋白的30% ，且大小与目的蛋白理论相对分子质量一致，约为56×103（图2A）。全菌样品分别以MBP、HuSOD1鼠单抗为一抗进行Western印迹分析，结果显示2条特异性条带，大小与理论值一致（图2B）。上述结果表明MBP-HuSOD1融合蛋白在大肠杆菌中获得表达，表达量约占全菌蛋白的30% ，其中可溶性蛋白占目的蛋白的63% 。

图2 MBP-HuSOD1诱导表达的SDS-PAGE（A）及Western印迹（B）

将菌体破碎样品稀释至1/20，采用NBT光化还原法测定SOD活性，以转化空质粒的全菌破碎样品为空白对照，全菌破碎样品对NBT光化还原反应的抑制率随酶液量的增加而增加（表1），表明转化pMAL-p5x-HuSOD1的全菌破碎样品具有SOD活性。

表1 SOD活性分析

2.3 MBP-HuSOD1融合蛋白的纯化

将诱导表达后的重组菌菌体超声波破碎，取上清，通过MBP亲和层析柱纯化，收集穿过和洗脱的蛋白进行SDS-PAGE分析，结果见图3。与对照菌裂解液相比，洗脱液样品在相对分子质量约56×103处有特异性条带，与预期相符，其中第8号样品特异性蛋白条带纯度大于95% ，表明纯化得到纯度为95% 的MBP-HuSOD1蛋白。

2.4 MBP-HuSOD1融合蛋白酶切与HuSOD1纯化

用因子Ⅹa将MBP-HuSOD1融合蛋白分别酶切2、4、8、24 h后进行SDS-PAGE分析，结果见图4。MBP-HuSOD1条带随酶切时间的延长逐渐减少，同时在相对分子质量约 40×103、16×103处出现蛋白条带，直至24 h时MBP-HuSOD1蛋白条带完全不可见，表明24 h时因子Ⅹa将MBP-HuSOD1融合蛋白完全酶切为MBP、HuSOD1。

图3 MBP-HuSOD1融合蛋白的纯化

图4 融合蛋白MBP-HuSOD1的因子Xa酶切分析

将经过24 h酶切的样品用分子筛层析分离后进行SDS-PAGE、Western印迹分析，结果显示蛋白条带约为16×103，与预期相同，且纯度约为90% ，表明纯化得到纯度为90% 的HuSOD1蛋白样品（图5）。

图5 HuSOD1蛋白的SDS-PAGE（A）及Western印迹（B）

3 讨论

目前，市售SOD主要从牛血清中提取，由于牛血清来源复杂，存在病原体污染的问题；而从植物中提取SOD的操作复杂，生产周期长，不利于大量生产，亟待开发获取SOD的新方法。利用大肠杆菌生长速度快、表达能力强的优点，王岚等[13]得到了高表达的SOD，但目的蛋白多以包涵体形式存在，包涵体蛋白折叠方式与蛋白的天然构象差异显著，影响蛋白发挥其生物活性。MBP融合表达技术有利于提高目的蛋白的表达量和可溶性表达比例[14-15]，本研究采用MBP融合表达系统表达了MBP-HuSOD1，占全菌蛋白的30% ，可溶性表达占目的蛋白的63% ，并进一步纯化和酶切得到纯度为90% 的HuSOD1蛋白。因此，通过MBP融合表达系统表达HuSOD1具有表达量高、可溶性表达比例高、纯化难度低等优点。此外，还可以通过继续优化诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间等条件提高表达量和可溶性表达比例。

综上所述，我们获得了MBP-HuSOD1，并纯化酶切得到HuSOD1。SOD1已广泛应用于食品、化妆品领域，在抗肿瘤、抗衰老等领域具有临床应用前景，因此本工作具有较大的意义和价值。