高效液相色谱法测定莶除湿膏中奇壬醇的含量*

王启斌

1十堰市太和医院，湖北 十堰 442000；2湖北医药学院附属医院

豨莶除湿膏是十堰市太和医院知名中医根据民间验方和三十余年的临床使用经验而研制的复方中药膏剂。本方主要由豨莶草、老鹳草，鸡血藤组成，具有祛风湿，利关节的重要功效。主要用于治疗风湿痹痛、筋骨无力、腰膝酸软、四肢麻痹、风疹湿疮等症。豨莶草为豨莶除湿膏中的君药，具有很好的祛风湿、利关节的作用，对细胞免疫和体液免疫都有抑制作用，对非特异性免疫亦有一定的抑制作用［1-2］。奇壬醇是其主要的药效成分，研究表明，奇壬醇可通过调整机体免疫功能、改善局部病理反应而达到抗抗风湿作用。且能降低麻醉动物血压［3］；腹腔注射奇壬醇对胸腺有抑制作用，降低血清抗体的滴度，减轻脾脏质量，抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，说明奇壬醇对细胞免疫和非特异免疫均有抑制作用［4］。豨莶草的质量研究主要以奇壬醇的含量为指标。为将豨莶除湿膏开发为本院特色制剂。本研究对豨莶除湿膏中奇壬醇进行含量测定，为进一步的豨莶除湿膏制备工艺和质量标准研究奠定基础。

1 仪器与试药

Prominence LC-20AT型液相色谱仪(日本shimadzu公司，二极管阵列检测器)；OHAUS DV215CD型电子天平(美国OHAUS公司，d=0.01 mg)；超声波清洗器(上海力朗仪器设备有限公司，功率100W，频率40 kHz)；奇壬醇对照品(供含量测定用，中国食品药品检定研究院，批号111726-201101)；乙腈(天津大茂，色谱纯)；水为双蒸水；豨莶除湿膏(规格：400 g/瓶)，本研究所用药材均经过十堰市药品检验所中药室鉴定，均为《中国药典》收载正品来源。其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 取奇壬醇对照品(经P2O5减压干燥器中真空干燥24小时并至恒重)适量，精密称定，以甲醇为溶剂配制成浓度为7.65 mg/mL的溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取豨莶除湿膏2瓶(同一批号)，混匀，称取约10.0 g，置具塞锥形瓶中，精密称定(十万分之一电子天平)，加甲醇50mL，浸渍30分钟，称定质量，超声处理5分钟(功率500 W，频率40 kHz)后，将溶液全部通过GDX-201型大孔吸附树脂柱(60～80目，内径为1 cm，柱高为12 cm，用甲醇清洗锥形瓶内壁，洗液一并通过大孔吸附树脂柱)，弃去流出液体，再用5%甲醇50 mL洗脱，弃去洗脱液，再用35%甲醇洗脱3次，第1次50 mL，第 2次 30 mL，第 3次 20 mL，收集35%甲醇洗脱液，回收甲醇，并浓缩至干，残渣用甲醇分次溶解，并完全转移至10 mL量瓶中，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 按处方量称取老鹳草、鸡血藤，加10倍量水煎煮二次，每次2小时，收集挥发油，合并煎液，静置，滤过，滤液浓缩至相对密度1.05，加入炼蜜500 g，混匀，滤过，滤过浓缩至相对密度1.10，放冷，加入提取中的挥发性成分，混匀，即得，取10.0 g，按供试品溶液制备的方法进行处理，得到阴性对照溶液。

2.2 系统适应性实验 根据预实验，拟采用Fortis Cortecstm C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相：乙腈-0.05%磷酸二氢钾溶液梯度洗脱(磷酸调节pH6.0)(程序见表1)；流速：1.0mL/min；进样量：20 μL ；柱温为 30℃；λ=215 nm［5-7］，在此条件下，奇壬醇色谱峰理论板数不小于5 000，分离度大于1.5，梯度洗脱程序见表1。色谱图见图1。

表1 梯度洗脱程序

图1 豨莶除湿膏中奇壬醇的HPLC图

2.3 标准曲线与线性范围 吸取配制好的奇壬醇对照品溶液 0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mL 分别置10 mL量瓶中，以甲醇为溶剂稀释并定容至刻度，摇匀，得到奇壬醇的浓度分别为0.38、0.76、1.53、3.82、6.12、7.65 mg/mL。分别以上述 6种浓度的奇壬醇对照品溶液进行测定，色谱条件为系统适应性性试验条件，以奇壬醇浓度(X）对奇壬醇色谱峰面积(Y）进行线性回归，得到奇壬醇浓度对奇壬醇色谱峰面积的线性回归方程为：奇壬醇Y=8.749 2X+0.058，r=0.999 9；上述结果表明，奇壬醇在0.38～7.65 mg/mL浓度范围内有良好的线性关系。

2.4 精密度实验 取奇壬醇对照品溶液(浓度7.65 mg/mL)20 μL，连续6次注入液相色谱仪，进行测定，记录奇壬醇的色谱峰保留时间和峰面积，结果奇壬醇色谱峰的保留时间稳定，其6次的色谱峰面积RSD为1.07%。

2.5 稳定性实验 将同一批豨莶除湿膏供试品溶液室温下分别在 0、2、6、12、24 小时时间点，按测定奇壬醇的色谱条件，记录奇壬醇色谱峰面积，计算各时间点色谱峰面积的RSD，结果为1.34%。2.6 重复性实验 分别将6份批号为20160309豨莶除湿膏制备成供试品溶液，按相同的色谱条件测定并记录奇壬醇的色谱峰面积，同时计算出6份豨莶除湿膏中奇壬醇的含量(外标两点法)，结果6批豨莶除湿膏中奇壬醇平均含量为4.68 mg/g，RSD 为 1.64%。

2.7 加样回收率实验 将9份批号为20160309的豨莶除湿膏(奇壬醇的含量为4.68 mg/g)每份称取5.0 g，用刻度吸管分别加入奇壬醇对照溶液(浓度为 7.65 mg/mL)2.0、3.0、4.0 mL(3 种不同水平，各3份)，按供试品溶液制备方法进行处理，并按照系统适应性试验条件进行测定，记录奇壬醇色谱峰面积，计算奇壬醇的含量(外标两点法)，结果奇壬醇的加样回收率为96.5%，RSD为1.54%。见表1。

表1 加样回收率实验结果

2.8 样品含量测定 按照制备工艺，制备6批豨莶除湿膏，按照供试品溶液的制备方法和色谱条件测定奇壬醇的含量，结果平均含量为4.47mg/g。见表2。

表2 样品含量测定结果(±s，n=3) mg/g-

表2 样品含量测定结果(±s，n=3) mg/g-

批号 奇壬醇20160309 4.68±0.16 20160412 4.03±0.13 20160517 3.54±0.06 20160608 4.59±0.11 20160721 5.18±0.04 20160813 4.79±0.12平均值 4.47

3 讨论

豨莶除湿膏为我院疗效较好的协定处方，多年的临床应用表明本方适用于风湿、类风湿的辅助治疗。为了提高本制剂的质量可控性。笔者对方中君药豨莶草主要药效成分奇壬醇进行了含量测定，其结果是稳定性好，重复性高，能达到有效控制本品质量的目的。在实验过程中，为使奇壬醇色谱峰分离度好，理论塔板数高，且使分析时间短，笔者对色谱条件进行了多次试验并调整。对比实验研究不同流动相：甲醇-磷酸、乙腈-醋酸等系统，发现这些流动相系统难以达到分析测定的目的。根据参考文献对豨莶草的含量测定条件，最后确定乙腈-0.05%磷酸二氢钾溶液体系梯度洗脱能满足对奇壬醇含量测定的要求。对奇壬醇的紫外最大吸收研究发现，在215 nm处有最大吸收。现代药理研究表明，奇壬醇可抑制佐剂性关节炎大鼠产生的白细胞介素1，从而可阻止大鼠关节软骨及骨质的破坏进程，减轻全身及局部病变进程。临床实验证实，奇壬醇对慢性增生性和糜烂性滑膜炎具有确切疗效。本次实验采用反相高效液相色谱法，能分离得到奇壬醇色谱峰，且能和其他杂质色谱峰相分离。本研究优化的测定方法具有准确度好、灵敏度高、重复性好的优点，能有效控制豨莶除湿膏的质量，为含有豨莶草的复方制剂的质量研究提供了参考。