清肝祛湿活血方对非酒精性脂肪肝大鼠肿瘤坏死因子α及肝脏组织的影响*

张玉香 ，王一强 ，姜德民 ，王凤丽 ，史晓伟 ，陈有源 ，王俊喹 甘肃省中医学校，甘肃 兰州 70050；甘肃省中医院；兰州市安宁区医院；西和县中医院

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，NAFLD)是肝细胞性肝硬化的重要病因［1-2］。近年来，发病率呈逐年上升趋势［3-4］。而中医药在治疗NAFLD方面起到越来越重要的作用，主要作用机制为调节脂肪组织分泌和储存、改善胰岛素抵抗、调节氧化应激等［5］，具有多靶点治疗、安全可靠的特点。清肝利湿活血方为王俊喹经验方，用于治疗肝经湿热瘀阻型NAFLD。前期临床研究［6］表明，其具有改善NAFLD患者临床症状，降低体质指数、腰围，改善肝功能和胰岛素抵抗，调节血脂代谢的作用。本研究采用高脂饮食建立NAFLD大鼠模型，观察清肝祛湿活血方对NAFLD大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)及肝脏组织病理形态学的影响，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取同批清洁级SD大鼠，雄性，90只，体质量130～170 g，由甘肃中医药大学动物实验中心提供，动物生产许可证号：SYXK(甘)2011-0001。

1.2 实验药物 清肝祛湿活血方药物组成：茵陈10g，郁金 10g，青葙子 10g，丹参 15g，夏枯草 10g，密蒙花10 g，垂盆草10 g。由甘肃中医药大学药学实验室制备中药煎剂。罗格列酮片(太极集团重庆涪陵制药厂有限公司生产，国药准字H20041399，规格4 mg/粒)。肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒均购自上海酶联生物研究所。

1.3 实验仪器 GS300型血糖仪(华广生技股份有限公司)；OHAUS1/1000型电子天平(美国BECKANCOULTER公司)；IX71-22FL/PH型倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)；LKB-Ⅲ型超薄切片机(瑞典LKB公司)；TC-120型生物组织自动脱水机(孝感泰维电子设备有限公司)；HH-S型数显水浴箱(金坛医疗仪器厂)；5417R型低温离心机(德国艾本德公司)；TC-120型生物组织自动脱水机(湖北泰维电子设备有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组与造模 将90只实验动物随机分为正常对照组，模型对照组，罗格列酮组，清肝祛湿活血方高、中、低剂量组，每组15只。大鼠适应性饲养7天，常规饮食，自由饮水。从第8天开始正常组给予普通饲料，连续60天；其余各组按照聂文山等［7］的造模方法，予高脂饲料(84%基础饲料+10%猪油+5%蛋黄粉+1%胆固醇)喂养1周后腹腔注射四环素(150 μg/g，然后每隔6天腹腔注射1次四环素)100 μg/g；分别于实验开始前及造模后第 6、12、18、24、30 天称量大鼠的体质量，依据造模大鼠体质量的变化改变给药量，造模时间30天。

1.4.2 给药方法 参考《药物试验方法学》［8］，按照人与大鼠的体质量换算，大鼠的等效剂量为：生药11.25 g/kg。中药复方高、中、低剂量组依次为生药22.50、11.25、5.63 g/kg。将清肝祛湿活血方用蒸馏水配制成浓度为0.28、0.56、1.13 g/mL的溶液。根据文献［9］报道，罗格列酮组用药剂量为3mg/(kg·d)造模成功后大鼠平均体质量按200g/只计算，干预组各大鼠每日灌胃给药1次，每次4 mL。正常对照组与模型对照组分别给予蒸馏水灌胃，1/d次，4 mL/次。各组大鼠连续灌胃30天，末次灌胃24小时后处死并测定相关指标。

1.4.3 观察指标

1.4.3.1 TNF-α测定 实验前大鼠空腹至少8小时，经鼠尾采血5 mL，室温放置2小时后，离心15分钟，3 000 r/min，取上清液，放冰箱-20℃保存。TNF-α采用酶联免疫吸附法定量检测。

1.4.3.2 肝脏组织病理形态观察 处死大鼠，迅速摘取肝组织，并将肝脏浸泡于10%甲醛内固定，石蜡包埋，切片，进行常规HE染色。肝组织脂变程度判断标准。见表1。

表1 肝组织脂变程度判断标准

1.5 统计学方法 所有数据均经SPSS 19.0统计学软件进行处理，计量资料用(±s)表示，采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清TNF-α 罗格列酮致大鼠死亡1只，中药复方低、中、高剂量组分别死亡2只，2只及4只。血清TNF-α水平，与正常对照组相比，模型对照组明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型对照组比较，清肝祛湿活血方各剂量组及罗格列酮组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清TNF-α水平比较(±s)

表2 各组大鼠血清TNF-α水平比较(±s)

注：*表示与空白对照组比较，P＜0.05；#表示与模型对照组比较，P＜0.05

组别 只数 剂量/(g·kg-1) TNF-α/(mol·L-1)空白对照组 15 - 0.88±0.14模型对照组 15 - 2.68±0.20*罗格列酮组 14 0.55 1.69±0.11#低剂量组 13 5.63 2.08±0.16#中剂量组 13 11.25 1.72±0.18#高剂量组 11 22.5 1.35±0.14#

2.2 肝脏组织病理形态 空白对照组大鼠肝脏外形大小正常，呈红色，肝小叶内未见脂滴肝细胞，为阴性。模型对照组大鼠腹腔肥大，肝体积增大明显，脂肪组织丰富，表面粗糙呈灰黄色，肝血窦扩张，充血，切面油腻感，胞质内几乎均呈脂滴肝细胞，为(++++)。与模型对照相比较，罗格列酮组，中药复方低、中剂量组大鼠肝脏脂肪组织含量减少，肝脏体积偏大，呈暗红色。脂变程度较轻，空泡样变肝细胞数目明显减少，胞浆内仅见少量脂肪滴，为(++)。中药复方高剂量组肝脏脂变程度明显减轻，肝小叶基本完整，空泡样变肝细胞消失，为(+)。见图1。

图1 肝组织病理切片(HE×400)

3 讨论

NAFLD的发病与胰岛素抵抗和遗传易感性关系密切。根据临床不同时期的临床表现可将其归属于中医学中“脂满”“肝著”“积聚”“痰证”等范畴。本课题组认为NAFLD的病机为肝火旺盛、湿热瘀结。清肝祛湿活血方以夏枯草清肝散郁；密蒙花清热泻火，养肝明目；青葙子清肝凉血；茵陈清热利湿、退黄；垂盆草清热解毒、利胆；丹参、郁金散结化瘀，行气通络。诸药合用活血化瘀，清肝祛湿［10-11］。

近来有关炎症因子TNF-α在NAFLD发生、发展中的作用备受关注［12］。TNF-α是机体炎症反应和免疫应答反应的主要调节因子，其可通过增加氧自由基和脂质过氧化而导致脂肪性肝纤维化。黄永红［13］研究指出，NAFLD发展到一定阶段时，脂肪组织中的TNF-α水平与胰岛素抵抗呈正相关。研究发现，TNF-α是非糖基化细胞因子，是炎症和代谢失衡的重要脂肪因子，可引起线粒体功能不全、肝细胞变性坏死及炎细胞浸润，加重脂肪肝的程度［14-15］。本研究结果也进一步证实，清肝祛湿活血方高剂量干预组可显著降低NAFLD大鼠TNF-α水平，说明清肝祛湿活血方可通过增强机体对TNF-α的清除能力来改善NAFLD。这与相关文献［16］报道一致。

综上所述，清肝祛湿活血方防治非酒精性脂肪肝可能的机制是下调肝脏TNF-α水平。