不同储藏条件下薏苡仁中真菌毒素含量变化的研究

王晓红，豆金彦，肖正国

甘肃省中医院药学部，甘肃 兰州 730050

近年来，随着我国中医药事业持续发展，中药的用药安全性也随之成为了关注的焦点。在影响中药安全性因素中，外源性有害残留物是其中最主要的一项因素，目前关于这方面的研究主要包括重金属、农药、真菌毒素残留以及二氧化硫等［1］。真菌毒素是一种经由真菌带来的二次有毒代谢物。目前已经发现的与人体有关的真菌毒素主要有玉米赤霉烯酮(ZON)、黄曲霉毒素(AF)以及赭曲霉毒素(OTA)等［2］。这些真菌均具有较强的毒性作用，可导致遗传毒性、生殖发育毒性以及细胞毒性等。有研究者发现，薏苡仁中检出AF或者ZON的频率非常高，由于薏苡仁非常容易受到真菌毒素的污染，同时其属于药食两用的常见中药，使用量非常大，且应用范围较广。为此，在《中国药典》中对ZON毒素含量做出了明确的规定［3］。但真菌的产生与其所处环境的温湿度、pH值等均密切相关，为此，模拟不同储藏环境，分析薏苡仁真菌含量变化，对控制薏苡仁真菌毒素含量，提高薏苡仁质量具有非常重要的作用［4］。本研究拟运用免疫亲和柱净化-在线柱后光化学衍生-高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)对低温密封、高温高湿以及药店要求通风干燥三种储藏条件下，薏苡仁的真菌毒素产生情况进行检测。现报道如下：

1 仪器与试剂［5-10］

1.1 仪器与设备 LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津)，光化学衍生器(美国AURA)，荧光检测器(日本岛津，RF-10AXL)，AZ二合一免疫亲和柱(中检维康)，KQ-500超声仪(昆山超声仪器)，ZKXF恒温干燥箱(利康达圣科技)，GF/A玻璃纤维滤纸(美国 VICAM，1.5 μm)等。

1.2 试药与试剂 薏苡仁样品(购自甘肃省中医院中药房)。黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素 G2(AFG2)混合对照品溶液；AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的浓 度 分 别 为 1.0、0.3、1.0、0.3 μg/mL(均 购 自美国 SUPLCO 公司)α- 玉米赤霉烯醇(α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)对照品(均购自ALDRICH公司)；水为超纯水；色谱分析以甲醇作为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

1.3 溶液配制

1.3.1 磷酸盐缓冲液配制 精确称取磷酸氢二钠2.9 g、氯化钠8 g、磷酸二氢钾0.24 g、氯化钾0.2 g，以990 mL水进行溶解，继续加入水稀释到1 L。

1.3.2 对照品溶液的制备 运用甲醇将ZON对照品溶液稀释成0.1 mg/mL使其能够被作为储备液；运用甲醇对α-ZOL进行溶解，并稀释至0.5mg/mL储备液；运用甲醇对β-ZOL进行溶解，并稀释至0.5 mg/mL储备液；AF对照品储备液则直接购入混合对照品，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 的浓度分别为 1.0、0.3、1.0、0.3 μg/mL。

2 方法

2.1 样品处理 准备2批薏苡仁，其中一批为自然污染严重，另一批为自然污染轻微，将其储藏在实验室。第一批样品：自中药房中购入一批去壳的薏苡仁，暂时将其储备在-20℃的冰箱内。在用于储藏实验处理之前，首先自冰箱内取出并对水分含量进行调节，使其达到12%。首先进行预检测发现大量ZON与少量AF。该批薏苡仁主要用于对真菌毒素污染水平较高时，不同的储藏环境下真菌含量变化的考察。第二批样品：另从中药房中购入新鲜未处理薏苡仁，对其进行干燥和脱壳处理，取1.5 kg将其装入干燥塑料袋内，暂时将其储存在-20℃的冰箱内。在行储藏实验之前，自冰箱内取出，并将其水分含量调整为12%。经过预检测，并未发现ZON与AF等其他方面的毒素。该批薏苡仁主要用于对轻微真菌污染或者无真菌毒素污染时，在不同的储备环境下，真菌毒素的含量变化以及产生情况进行考察。

2.2 储藏条件 本研究拟设计低温密封、高温高湿以及药店要求通风干燥3种储藏条件。1)低温密封：运用四分法分别从上述2批样品中各取500 g，将其密封，放置到4℃的冰箱中。2)高温高湿：运用四分法分别从上述2批样品中各取500 g，取干净玻璃皿盛放，放置到30℃的恒温箱内，在恒温箱内放置饱和食盐，湿度控制在75%左右。3)通风干燥：运用四分法分别从上述2批样品中各取500 g，运用干净塑料袋盛放并放置到实验室内，将塑料袋口敞开，保持空气流通。在实验过程中，实验室温度主要由季节变化以及中央空调进行调控，通常为15～25℃，湿度为40%左右。

2.3 检测方法 在不同储藏条件下，分别储存0、30、90 天，以四分法均匀称取 50 g，取样品，对其 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、α-ZOL、β-ZOL7 种真菌的毒素含量进行定量检测。采用HPLC-FLD进行检测。

2.3.1 色谱条件 色谱柱phenomenex Luna 5 μC18(2)100 A(50×2.00 mm 5micron)，流动相：A相，乙腈-0.1%甲酸；B相，水-0.1%甲酸。梯度洗脱程序：0.01～1.5 min，5%A；1.5～2.5 min，5%A～95%A；2.5～5.0 min，95%A；5.0～5.01 min，95%A～5%A；5.01～8.0 min，5%A。流速：0.4 mL/min；进样量：10 μL。

2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源为离子源，正负离子方式同时进行检测，源温度：500℃，喷雾电压：(-)4500V，(+)4500V；氮气作为气帘气(CUR)、雾化气(GS1)、碰撞气(CAD)、辅助气(GS2)，其中CUR：30.0psi，GS1：55.0psi，CAD：Medium，GS2：65.0psi。

3 结果

3.1 薏苡仁AF含量 根据检测结果来看，自中药房购入的薏苡仁经过运输、加工以及保存等各种环节而受到污染产生出真菌。在储藏0天，第一批薏苡仁检出了AFB1与AFB2，但其含量非常的低，储藏30天后，均未出现较大的变化。储藏90天时，AFB1与AFB2含量均有明显增加，但在干燥通风条件下的样品，其AFB1与AFB2增长的幅度最大，分别增长了 1.64 μg/kg 与 16.46 μg/kg；在高温高湿的环境下，AF的含量增长幅度最少；而在低温密封条件下，样品并未出现发霉情况，但仍然持续产生AFB1，经过90天的储备，AFB1的含量达到了4.96 μg/kg，这已经达到了中药材AF毒素含量的限定值。第二批样品在储藏过程中，从最初的不含 AF，到储藏 30、90天均检测出 AFB1，但含量非常的少，在0.10～0.16 μg/kg范围内，但并未发现其他AF。这表明新鲜的薏苡仁在进行采收之前并没有受到AF真菌的侵染，或者仅仅受到了轻微的侵染，但未达到形成AF的条件。随着储藏时间的延长，储藏温湿度等各个方面的条件逐步合适，薏苡仁在储藏过程中，也随之产生了AFB1，为此储藏环境必须引起我们的共同重视［11］。根据上述结果来看，在通风干燥的条件下对薏苡仁进行储备，可致使真菌毒素迅速增加，尤其是AFB1与AFB2增加幅度最大；而在高温高湿的储藏条件下，AF含量却未出现较为明显的变化；而在低温密封的储藏条件下，薏苡仁中AF含量表现为缓慢增长。见表1。

表1 不同储藏条件下薏苡仁AF毒素含量测定结果 μg/kg

3.2 薏苡仁ZOL、ZON含量 根据检测结果来看，第二批样品，最初并未含有ZON，但经过一段时间的储藏后，3种条件下均检测出了一定的ZON，这表明任何储藏条件均会致使薏苡仁受到ZON污染。第一批样品在不同储藏条件下ZON含量变化与第二批样品含量变化表现出明显的一致性。主要表现为：1)在低温密封的环境下，新鲜薏苡仁未受到ZON真菌的污染，直至储藏9天才检测发现ZON，含量达到了 126.07 μg/kg；而购自中药房的薏苡仁样品，从储藏0天至储藏90天，其ZON含量从最初的 177.75 μg/kg，减少了 105.95 μg/kg。2)在高温高湿与通风干燥的环境下，ZON含量均表现为先大幅度的上升，再迅速下降，甚至表现为较为明显的负增长趋势，但仍然具有较高的残留值。在储藏时间达到30天时，通风干燥条件下的薏苡仁ZON含量仍然最高，达到了281.45 μg/kg，该结果与相关研究报道结果一致。有研究者发现［11-12］，在一定的储藏环境下，小麦的ZON含量会表现为非常明显的先增加再下降的趋势，同时在22℃时，真菌产毒量明显较之28℃时更高。在室温条件下，ZON化学结构非常的稳定，而其储藏过程中出现含量下降，可能是受到温湿度条件的影响，真菌自身发生代谢或者其他微生物对其进行了分解等原因所致，但具体的机制还需要作进一步的分析。3)持续储藏0、30、90天，无论是加工后薏苡仁(第一批样品)，还是新鲜薏苡仁(第二批样品)均未检测发现α-ZOL与β-ZOL。根据上述结果来看，在高温高湿以及通风干燥的环境下，薏苡仁中ZON会迅速增加，在通风干燥的环境下，薏苡仁ZON含量所增加的幅度更大，而在低温密封的环境下，短时间内可对ZON含量进行抑制。见表2。

表2 不同储藏条件下薏苡仁ZOL、ZON毒素含量测定结果 μg/kg

4 讨论

在通风干燥的储藏环境下，薏苡仁非常容易产生大量的ZON与AF。针对该结论，还需大批量研究样本作验证真菌毒素的形成与积累的具体机制，以及不同条件下对薏苡仁中真菌毒素含量变化的影响也需要进一步的研究。关于真菌毒素产生的主要阶段，不同的研究者看法不同，付朝晖等［7］研究认为真菌除了生长后期会产生真菌毒素，同时在快速线性生长的过程中也会形成大量的真菌毒素。另有研究者［11］表示，真菌毒素非常容易因生长和营养耗竭等因素而受到限制。

通过建立低温密封、高温高湿以及通风干燥3种储藏条件，对薏苡仁进行为期90天的真菌毒素含量变化检测分析，根据结果来看，在不同的储藏环境下，真菌毒素含量会有明显的改变；在通风干燥的条件下，薏苡仁中ZON与AF两种毒素的含量会出现非常明显的增加，伴随着时间的延长，AF含量也会表现出明显的上升趋势，而ZON则随着储藏时间的增加而下降；在高温高湿的环境下，AF含量并未出现较为显著的改变，ZON含量则首先出现非常显著的升高；在低温密封储藏条件下，薏苡仁中ZON与AF的产生与积累的速度都非常的缓慢。