消银汤对小鼠鼠尾表皮细胞分化及Th1/Th2型细胞因子的影响*

薛晓东，宋红霞

1重庆三峡医药高等专科学校附属医院皮肤科，重庆 万州 404000；2重庆三峡医药高等专科学校药理教研室

银屑病是一种由多基因遗传、多环境因素刺激诱导的免疫异常性的慢性、增生性、炎症性皮肤病［1-4］。消银汤是笔者的临床经验方，治疗寻常型银屑病疗效满意。本研究以鼠尾鳞片表皮模型为银屑病的动物模型，观察消银汤对银屑病小鼠模型的治疗作用，并以Th1/Th2细胞因子为切入点探讨其可能的作用机制，从而为临床应用提供实验依据。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 动物 昆明种小鼠50只，SPF级，体质量为18～22 g，雌雄兼用，由重庆医科大学实验动物中心提供，动物实验合格证号：SYXK(渝)2012-0001；在温度 16～26℃，相对湿度40%～70%实验环境下饲养。

1.2 药物与仪器 消银汤药物组成：黄芩10 g，生地黄15 g，牡丹皮12 g，赤芍15 g，半枝莲30 g，白花蛇舌草15 g，槐花10 g，紫草10 g，玄参15 g，丹参15 g，鸡血藤15 g，甘草6 g。制备方法：称取各药材，用水煎煮制备，共煎煮2次，煎出液合并，浓缩到每剂药168 mL。消银汤的人体推荐摄入量为168 g/d生药，相当于2.8 g/(kg·d)生药(成人以60 kg计)。甲氨蝶呤片(上海信谊药业有限公司，批号：20130403)，小鼠 IFN-γ、IL-4 ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，批号：201310)，光学显微镜(日本奥林巴斯公司)，LP-400酶标仪(法国巴斯德公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组 取昆明种小鼠50只，雌雄各半，将小鼠随机分为5组，每组10只，即空白对照组(等体积生理盐水)，消银汤高剂量组(69.0g/kg)、中剂量组(34.5 g/kg，相当于临床等效剂量)、低剂量组(17.3 g/kg)，甲氨蝶呤组(2 mg/kg，相当于临床等效剂量，用生理盐水配制成所需浓度)，各组灌胃给药，每天2次，连续14天，给药容积为35 mL/kg。

1.3.2 小鼠尾部鳞片颗粒层鳞片数 末次给药24小时后进行眼球取血，室温静置15分钟，3 000 r/min离心15分钟后分离血清，置于-70℃保存，用于IFN-γ、IL-4的浓度测定。处死小鼠后，取鼠尾距根部约1.8 cm处的背面皮肤一长条(1.5 cm×0.2 cm)，进行 10%甲醛固定，石蜡包埋，组织切片，HE染色，光镜下观察每个小鼠的尾部鳞片并计数每100个鳞片中有颗粒层的鳞片数(凡鳞片表皮有连续成行的颗粒细胞层者，称为有颗粒层形成的鳞片)。对各组数据进行比较，并作统计学处理。

1.3.3 小鼠血清细胞因子IFN-γ、IL-4含量 从冰箱取出各组血清样本，恢复至室温，操作步骤按照IFN-γ、IL-4 ELISA试剂盒说明书进行。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行数据统计分析，计量资料以(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠尾部鳞片表皮颗粒层形成数 小鼠尾部鳞片表皮颗粒层形成数消银汤高、中剂量组，甲氨蝶呤组与空白对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；消银汤高剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；消银汤低剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.2 小鼠血清IFN-γ、IL-4含量 IFN-γ、IL-4消银汤高、中、低剂量组和空白对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。消银汤高、中、低剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表1 各组小鼠尾部鳞片表皮颗粒层形成数比较(±s)

表1 各组小鼠尾部鳞片表皮颗粒层形成数比较(±s)

注：a表示与空白对照组比较，P＜0.01；b表示与甲氨蝶呤组比较，P＜0.01

组别 只数 剂量/(g·kg-1) 有颗粒层的鳞片数/100个鳞片空白对照组 10 - 6.61±2.86消银汤高剂量组 10 69.0 19.45±4.17ab消银汤中剂量组 10 34.5 13.56±3.04a消银汤低剂量组 10 17.3 7.37±3.13甲氨蝶呤组 10 2.0 14.79±3.93a

表2 各组小鼠血清IFN-γ、IL-4含量比较(±s)

表2 各组小鼠血清IFN-γ、IL-4含量比较(±s)

注：a表示与空白对照组比较，P＜0.01；b表示与空白对照组比较，P＜0.01

组别 只数 剂量 /(g·kg-1)IFN-γ/(ng·mL-1)IL-4/(ng·mL-1)空白对照组 10 - 7.09±2.10 3.66±1.67消银汤高剂量组 10 69.0 3.29±1.08b 6.64±2.28b消银汤中剂量组 10 34.5 4.16±1.39b 6.00±2.12b消银汤低剂量组 10 17.3 4.86±1.50b 5.45±1.43a甲氨蝶呤组 10 2.0 3.83±1.29 5.66±1.73a

3 讨论

银屑病模型包括银屑病小鼠模型、佛波酯诱导动物模型、异种移植动物模型、自发性或基因突变模型、异种移植动物模型等，但均不能完全反映银屑病的组织病理学特点，其应用均具有局限性［5］。银屑病表皮的主要病理生理学特点包括增生过快和角化不全2个方面［6］。小鼠尾部鳞片的表皮因天然颗粒层细胞缺失，故可模拟银屑病角化不全的特点。通过比较小鼠尾部有颗粒层的鳞片数，可以较好地评价药物促进颗粒层形成的作用［3］，该模型被作为筛选抗银屑病药物的常用模型［5］。

银屑病发病机制尚不清楚，目前实验研究表明T细胞介导的免疫紊乱是银屑病发生发展的基础［7］，其中活化的Th细胞发挥关键性作用［8］。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等细胞因子，主要功能为参与调节细胞免疫，介导细胞免疫应答，辅助细胞毒性T细胞分化，参与迟发性超敏反应等；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等细胞因子，主要功能为介导体液免疫应答，辅助B细胞增殖与分化，参与Ⅰ型超敏反应等［9］。近年来Th1/Th2比例失衡学说受到异常关注，认为银屑病患者Th1细胞分泌的细胞因子明显增多，而Th2细胞分泌的细胞因子相对减少是引起银屑病发病的重要原因，且表现为典型的Th1优势应答［10］。由于Th1细胞以分泌IFN-γ为特征，Th2细胞以分泌IL-4为特征，故IFN-γ/IL-4可作为Thl/Th2细胞失衡的主要指标［3］。

本研究结果表明，消银汤高、中剂量组均可显著增加小鼠尾部鳞片颗粒层形成数，其中高剂量组与甲氨蝶呤组比较差异有统计学意义；各剂量组均可显著降低IFN-γ的水平，并可升高IL-4的水平，与甲氨蝶呤组比较差异无统计学意义。提示消银汤可能通过调节Th1/Th2细胞因子动态平衡，促进小鼠尾部表皮颗粒层细胞形成而发挥治疗作用。