鸡β —防御素7的克隆与表达

张开娟 云骜 杨猛 卢艳 王文华

摘要：防御素在抗生素取代方面有良好的发展前景，但目前在防御素大规模表达方面仍有难点。本实验着重探究如何实现防御素的大规模表达。实验通过设计目的基因引物、PCR扩增目的基因、将鸡8防御素7（AvBD7）基因克隆到大肠杆菌BL21表达载体质粒pET32a中、扩增大肠杆菌、对鸡AvBD7基因进行鉴定、分离纯化目的蛋白并进行检测的过程方法，完成重组鸡AvBD7基因的克隆与表达，得到鸡AvBD7基因可以在大肠杆菌BL21中表达的结论，为鸡AvBD7基因的进一步临床应用打下基础。

关键词：β-防御素；原核表达；蛋白质诱导表达；蛋白质检测

中图分类号：S8 31.2

文献标识码：A

文章编号：2095-9737（2018）06-0001-04

防御素是一种具有广谱高效的抗微生物活性[1]和非特异性细胞毒作用及调节体内适应性免疫的阳离子活性肽[2]，具有独特的抗菌机理。早在1965年由Hrish等首次从兔的PMN中提取出1种具有杀菌活性的阳离子蛋白，称为“吞噬素”，之后Zeya和Spitznageleta發现此阳离子活性蛋白富含精氨酸和半胱氨酸，并将其命名为“溶酶体阳离子蛋白”[3]。20世纪80年代，Ganz等由于其广谱的抗微生物活性首次将其命名为“防御素”，且Evans首次从鸡的异嗜性白细胞中分别纯化得到Ga-ll～2[4]，之后国际统一将防御素命名为AvBD。8防御素最先从牛的支气管黏膜上皮细胞中分离得到，鸡中的防御素均为β-防御素，β-防御素7主要分布于鸡的骨髓[5-6]。

防御素相对分子质量较小，热稳定性和水溶性均较好，可以在肠道内吸收，且防御素属于多肽成分，在体内容易被蛋白酶降解为氨基酸，动物采食后在体内一般无残留，故在畜牧业中有良好的应用前景。但防御素在鸡体内含量较低，对其进行提取纯化不仅在技术上有一定的难度，而且若想获得大量的目的蛋白，需要投入大量的人力物力。通过基因工程可实现防御素的大量表达，使其成为一种不易使病原微生物产生耐药性的、具有良好前景的“抗生素替代品”[7-8]，减少抗生素广泛运用带来的危害。基于鸡β-防御素1—6的研究基础，本实验选用遗传背景清楚、生长繁殖快、转化效率高、成本低廉的大肠杆菌表达系统对鸡AvBD7基因进行初步研究，完成鸡AvBD7基因的克隆与表达。

1 材料与方法

1.1 试验材料

实验菌种及质粒载体：菌株大肠杆菌BL21、质粒载体pET32a由山东农业大学动物分子病理实验室提供。

主要试剂：限制性内切酶EcoR I、Not I、T4DNA连接酶、TaKaRAa DNA marker购于宝生物公司，质粒提取、PCR产物纯化试剂盒与RNA提取试剂盒购于天根公司，SDSPAGE凝胶快速配置试剂盒（产品编号：P0012AC）购于碧云天公司。

主要仪器：PCR仪购于Eppendorf公司，恒温培养箱与超净工作台购于上海博讯公司，凝胶成像系统购于北京君意公司，恒温摇床购自上海申能博彩公司，细胞超声波粉碎机购于宁波新芝生物有限公司，SDS- PAGE电泳槽购于北京六一公司。

1.2 试验方法

1.2.1 引物的设计与合成

根据Genbank中登记的鸡AvBD7基因序列（登录号NM_ 001001194.1），应用Premier5.o软件设计一对引物。AvBD7 F的5端有EcoRI酶切位点，AvBD7 R的5端有NotI酶切位点。设计好的引物由华大基因科技公司合成。PCR扩增所用引物（见表1）。

1.2.2

PCR扩增鸡AvBD7基因序列

以鸡AvBD7基因序列为模板，用合成的引物扩增出鸡AvBD7基因序列。PCR反应步骤：94℃变性5 min；开始将下面三个步骤进行32个循环：变性（94℃，40 s），退火（59℃，30 s），复性（72℃，l min）；最后72℃反应10 min。得到的PCR产物进行凝胶电泳。切下含鸡AvBD7基因条带的胶块进行纯化后送华大公司测序。

下面是含鸡AvBD7基因胶块纯化的步骤（使用前先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加人体积参照瓶上的标签）。

柱平衡步骤：本步骤需要使用当天处理过的柱子。向放人收集管中的吸附柱CA2中加入500 μL平衡液BL，12000 r/min离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放人收集管中。

将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，注意要尽量切除多余部分。将条带放人干净的离心管中，称取重量。

向胶块中加入等倍体积溶液PN。如果凝胶重为0.lg，其体积可视为100 μL，则加入100 μL PN溶液。将体系于50℃水浴放置，其间不断温和的上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解，若还有未溶的胶块，则继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解。胶块体积过大时，需事先将胶块切成碎块。

将上一步所得溶液加入置于收集管中的吸附柱CA2中，室温放置2 min，12000 r/min离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。吸附柱容积为800μL，若样品体积大于800 μL，需分批加入。

确认已加入无水乙醇后，向吸附柱CA2中加入600 μL漂洗液PW，12000 r/min离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

重复上一步操作步骤。

将吸附柱CA2放回收集管中，12000 r/min离心2 min，尽量除尽漂洗液，再将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底的晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步实验。

将吸附柱CA2放于一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液BE，室温放置2 min，12000 r/min离心2 min收集DNA溶液。进行后续测序时，需使用ddH20做洗脱液，并保证其pH值在7.O～8.5范围内，pH值低于7.0会影响洗脱效率。另外DNA产物应该保存在 20℃，以防DNA降解。DNA也可以用缓冲液（lOmMTris- Cl，pH8.o）洗脱。为了提高DNA回收量，需将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2 min，12000 r/min离心2 min，将DNA溶液收集到离心管中。

1.2.3 重组鸡AvBD7基因表达载体的构建

PCR扩增产物经纯化后用EcoRI和NotI双酶切，酶切后对其进行回收纯化，然后与经双酶切并纯化的质粒pET32a连接，转化BL21感受态细胞并用具有氨苄青霉素的平板筛选转化子，转化子在平板上生长出两个菌落，摇菌扩增之后，分别进行菌落PCR，所用引物与目的基因引物相同。经测定，两个菌落均成阳性，但其中一个菌落条带更加明亮。选取此菌落转化子进行后续实验。将阳性菌送华大基因公司测序，并将连接转化菌体序列与实验PCR所得基因序列作对比。

鸡AvBD7基因双酶切反应体系和连接转化反应体系（见表2、表3）

1.2.4重组鸡AvBD7基因的诱导表达与提取纯化

将测序正确的菌株接种于100 mL LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养至浑浊后加入蛋白诱导剂IPTG，继续培养一段时间，收集菌体，超声破碎，收取沉淀和上清液分别做SDS- PAGE，确定其蛋白表达是在沉淀包涵体中。然后再经过条件优化摸索出最佳诱导的IPTG浓度及时间，从而提高蛋白的表达，即将AvBD7载体菌扩增至OD=0.6，加入蛋白诱导剂IPTG使其终浓度为1 mmol/L，37℃恒温摇床继续培养6h，分别取加入IPTG后Oh、2h、4h、6h4个时间节点的菌体，超声破碎，取包涵体并进行包涵体纯化后，进行SDSPAGE检测。检测鸡AvBD7基因的诱导表达情况。

包涵体的提取与纯化步骤：将大量表达的菌液收集并分装入lOmL离心管，4℃，8000 r/min，离心25 min；根据收集菌量加PBS重悬菌液，分装于1.5 mL的EP管。用超声破碎仪破碎大肠杆菌，4℃，12000 r/min，离心15 min，弃上清液。用9倍体积的洗涤液I重悬沉淀，室温静置5 min；12000 r/min，15 min，弃上清液。用9倍体积的洗涤液Ⅱ重悬沉淀，室温静置5 min；12000 r/min，15 min，弃上清。用9倍体积的洗涤液重悬沉淀，室温静置5 min；12000 r/min，15 min，弃上清。按照100 mL菌液加4 mL溶解液的比例加入溶解液充分溶解th后，12000 r/min，15 min，所得上清液就是溶解的包涵体。

2 结果

2.1 PCR获得鸡AvBD7基因

PCR扩增得到约300bp的鸡AvBD7基因序列，如图1。鸡AvBD7基因大小是514bp，PCR所得鸡AvBD7基因包含编码区的基因片段。

PCR所得鸡AvBD7基因与从Genbank中所获得的基因符合度较高，CDS区完全一致，如下图2、3。

2.2 成功构建重组鸡AvBD7基因表达载体

获得EcoRI和Notl双酶切并回收纯化的PCR扩增产物，如图4。

表达载体质粒pET32a双酶切，如图6。

对大肠杆菌BL21转化子进行菌落PCR，得到两个阳性菌落，如图5。

连接转化菌体序列与实验PCR所得基因序列作对比，可见鸡AvBD7基因已正确连接到菌体中，如图7。

2.3 完成重组鸡AvBD7基因的诱导表达与提取纯化

鸡AvBD7成熟肽表达的大小在6kb左右，但本实验重组表达的鸡AvBD7基因因与his标签的共同表达，故大小约在20kb。如图可见蛋白在沉淀中表达较多，可证明蛋白是在包涵体中表达，如图8。

获得时间梯度下，经IPTG诱导的蛋白表达，由图可见，鸡AvBD7蛋白表达量随时间梯度变化，且在4h表达的最多，如图9。

3 讨论

调查发现，在家禽的集中化养殖模式中，抗生素被广泛应用。然而长期使用抗生素会使禽群的耐药性提高，且抗生素易在家禽体内残留，不利于养殖业健康的发展。之前的研究表明防御素具有广谱高效的抗微生物活性和独特的抗菌特性，可以避免禽群耐药性的产生，且作为一种天然抗菌肽，防御素也不存在药物残留的问题，可以有效提高农产品的安全性[9]，由此可见，防御素具有极高的研究意义。但天然防御素在动物体内含量少且提取操作较为复杂，成本高，若利用基因工程手段构建防御素基因表达载体，将载体转入合适的宿主表达细胞，便能大量生产防御素，为防御素的广泛利用提供有效的途径[10]，因此防御素在基因工程上具有很大的发展潜力。

实验通过查阅文献获得防御素的基本信息，确立了对鸡AvBD7基因的研究方向，根据Genbank中登记的鸡AvBD7的基因序列设计出引物并使用质粒pET32a完成鸡AvBD7基因表达载体的构建，利用转化效率高且成本低廉的大肠杆菌原核表达系统，成功诱导蛋白质表达并运用SDS - PAGE完成了对表达产物的测定。由实验可得，100 mL LB菌液可得到4 mL浓度为100～200 μg/mL的蛋白质溶液。为保证实验成功，实验操作中有许多需要注意的地方，例如在鸡AvBD7基因胶体纯化步骤中，洗脱液体积不应小于30 μL，体积过小影响回收效率，且需要严格控制洗脱液的pH值来保证洗脱效率。

未来需要进一步对鸡AvBD7基因的作用进行探究，例如对其在抗菌抑菌、抗肿瘤效果及其临床应用等方面进探究，去发现当前未被发现的性能，挖掘其更大的功能意义，使鸡AvBD7基因的实际应用价值的得到更大的提升。

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