某地区人群妊娠期糖尿病与线粒体基因突变的相关性分析

罗 晶 丁 丽 肖玉红

（中国人民解放军第二○二医院内分泌科，辽宁 沈阳 132011）

糖尿病（diabetes mellitus）目前已经成为严重威胁国民健康的最重要的内分泌疾病之一[1]。研究表明其发病具有遗传易感性，是环境因素和遗传因素共同作用的结果。妊娠期糖尿病（GDM）与糖尿病发病机制相似[2]，其主要是指妊娠后首次出现的不同程度糖耐量减低的疾病[3]。近年来GDM的发病率呈明显上升趋势。它不但影响胎儿的宫内发育，而且还会对胎儿出生后的健康产生不利影响。通过线粒体基因突变的检测，对GDM的发病进行预测，并给予干预，将对GDM的防治有重要意义。本研究通过对GDM患者进行线粒体基因突变类型的筛查，并与健康对照组进行比较，分析线粒体基因突变是否参与GDM的发病过程。

1 材料与方法

1.1 临床资料：选取2012年7月至2013年6月因停经就诊于沈阳军区202医院妇科门诊确诊妊娠者296例，并签署知情同意书。排除糖尿病合并妊娠（第1次孕检FPG≥7.0 mmol/L），患有心肝肾和其他系统严重疾病等可能影响实验结果者。妊娠糖尿病的诊断参考2010年国际妊娠期糖尿病专家组制定的标准[4]：妊娠24～28周时，OGTT 0 h≥5.1 mmol/L或1 h≥10.0 mmol/L或2 h≥8.5 mmol/L，任意一点血糖达到以上标准可诊断。同时在妊娠24～28周收集妊娠者的外周静脉血样本。其中妊娠糖尿病组有146例，年龄（27.5±3.9）岁；正常对照组有150例，年龄（29.5±4.8）岁。根据知情同意原则，常规抽取外周静脉血，用以进行基因组DNA的提取。

1.2 基因组DNA提取：取外周静脉血2 mL，加0.2 mLEDTA抗凝剂，充分混匀。采用常规酚/氯仿抽提法提取DNA，并进行DNA浓度及纯度的测定。

1.3 PCR扩增：采用英国Pregene公司PCR扩增仪。3394引物：上游为5'-TACTYCACAAAGCGCCTYCC-3'，下游为5'-ATGAAGAATAGGGC GAAGGG-3'。3316引物：上游为5'-CACCCAAGAACAGGG1TITI1GT-3'，下游为5'-CGTCAGCGAAGGGTFGTAGT-3'。3243引物：上游引物为5'-AGCGCCTTCCCCCGTAAATGA-3'，下游引物为5'-AGAATGA TGGCTAGGGTGACTTC-3'。

1.4 反应体系：反应体系25 μL，含50 ng DNA，70 pmol/L引物，200 μmol/LdNTPs，50 mmol/LTris-HCl（pH8.8），1.5 mmol/LMgC12，0.15%Triton-100，1.5 U TaqDNA聚合酶。

1.5 PCR条件：PCR热循环在icyclerTMThermalrealcycler（Bio-Rad）上进行。95 ℃预变性5 min，然后按95 ℃ 30 s 、60 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，循环30次，72 ℃延长5 min，4 ℃保存。

1.6 点突变检测：点突变检测采用琼脂糖凝胶电泳，直接测序法（Sanger法）测序，测序工作在测序生物公司完成，序列比对采用Seqman和Chromas软件分析。

1.7 统计学分析：用SPSS14.0统计软件分析。基因突变位点在健康对照组和妊娠期糖尿病组中的频率分布的差异用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

线粒体G3316A基因突变：妊娠期糖尿病组中检出G3316A突变7例（4.79%），健康对照组检出1例（0.67%），G3316A突变在妊娠期糖尿病组发生率显著高于对照组（P＜0.05）。线粒体A3243G基因突变：妊娠期糖尿病组中检出A3243G突变5例（3.42%），健康对照组检出0例，A3243G突变在妊娠期糖尿病组发生率显著高于对照组（P＜0.05）。在妊娠期糖尿病与正常对照组中均未发现T3394C位点的突变。见表1。

表1 妊娠糖尿病组与正常对照组G3316A、A3243G、T3394C基因突变位点比较

3 讨 论

线粒体DNA与核DNA比较更容易受到损伤，因此突变率要高10～20倍。线粒体基因突变引起的线粒体功能障碍可引起线粒体疾病，与肿瘤、糖尿病等密切相关[5-8]。最常见的引起2型糖尿病的线粒体基因突变是tRNALeu（UUR）基因A3243G，其次是ND1基因G3316A、T3394C、A3426G和ND4基因A12026G，以及D环区的T16189C。阈值效应是mtDNA突变基因的表型表达的特征之一，临床表型的变化是否出现取决于突变的mtDNA数量是否超过一定的阀值[9]。mtDNA基因突变造成线粒体功能障碍，能量供应不足引起β细胞功能低下[10]。线粒体功能障碍还会影响细胞对葡萄糖的有氧代谢能力，从而产生胰岛素抵抗的现象[11]。GDM有母系遗传的倾向，所以线粒体基因突变很可能在妊娠糖尿病的发病过程中发挥更加重要的作用。本研究共包括妊娠期糖尿病组149例，对照组150例，研究结果表明线粒体基因A3243G、G3316A突变与妊娠期糖尿病发病有关。线粒体基因T3394C突变并未在本研究的妊娠期糖尿病患者和健康对照组中，可能与样品量有限和地区差异有关。总之，本研究结果表明，在辽宁地区人群中，妊娠期糖尿病与mtDNA3243、3316位点的突变具有相关性。对于线粒体DNA突变如何在妊娠期糖尿病发病过程中起作用，需要扩大样本量进行更加深入的研究。