瘦素功能性受体Ob-Rb表达对胰腺癌细胞迁移的影响

谭美玉 田晓宇 姚怡婷 张骏 盛慧明 徐伟红(通讯作者)

（1上海市同仁医院检验科 上海 200050）

（2华山医院消化病研究所 上海 200041）

瘦素（leptin）是一种主要由脂肪细胞制成的激素，有助于通过抑制饥饿来调节能量平衡[1]。虽然脂肪储存的调节被认为是瘦素的主要功能，但它也在其他生理过程中发挥作用，包括自身免疫、糖尿病的发生与调节[2]。目前关于瘦素及其受体对胰腺癌影响的研究较少，本文就瘦素功能性受体Ob-Rb的表达对胰腺癌细胞迁移的影响展开研究，详述如下。

1.材料与方法

1.1 细胞培养

人胰腺癌细胞系PANC-1（CRL-1469，ATCC，USA）保存于DMEM培养基中（Sigma，USA），治疗前将胰腺癌细胞血清饥饿16小时，然后用100ng/mL人瘦素（Q6NT58，R&D Systems，USA）处理。

1.2 逆转录PCR（RT-PCR）

使用RNA抽提试剂盒（PureLink，Thermo Fisher，USA）提取细胞总RNA，使用cDNA合成试剂盒（RK20400，ABclonal，USA）合成第一链，后用FastQuant RT试剂盒（KR106，TIANGEN，北京）以合成的cDNA作为模板进行逆转录，行琼脂糖凝胶电泳，检测Ob-Rb的mRNA表达情况。

1.3 蛋白印迹（Western Blot，WB）实验

使用裂解液+10μL苯甲基磺酰氟（PMSF）将细胞裂解，离心（4℃，10000rpm，5min）取上清液，使用考马斯亮蓝（Bradford）法[3]检测蛋白含量后，使用SDS-PAGE电泳分离蛋白并通过转膜将其印迹到PVDF膜上，用SuperBlock封闭缓冲液（Thermo Scientific，USA）封闭后，用Ob-Rb抗体（Proteintech Group，USA）孵育，化学显影探测印迹[4]。

1.4 细胞迁移实验

使用细胞划痕测定法（wound-healing assay）测量，每组重复五次取平均数。先在12孔板后画横线标记，将胰腺癌细胞消化后接种入12孔板铺满板底，用无菌枪头尖端刮擦使汇合的细胞单层受伤，后吸去细胞培养液，用PBS缓冲液洗涤细胞以除去划擦产生的碎片，加入瘦素处理。放入培养箱中培养，每隔6小时检查平板并使用相差显微镜拍照，通过计数迁移到伤口中的细胞数量来定量细胞迁移，未用瘦素处理的细胞作为对照[5]。

1.5 数据分析

数据资料利用SPSS24.0先进行正态性检验，若满足正态性且组间方差齐，我们采用t检验进行组间比较，反之则考虑非参数Mann-Whitney U检验；采用Pearson相关性分析方法，分析Ob-Rb表达与胰腺癌细胞迁移的相关性；以P＜0.05为差异有统计学意义，所有检验均为双侧检验。

2.结果

2.1 胰腺癌细胞中Ob-Rb表达情况

Ob-Rb全长1071bp，WB显示Ob-Rb识别瘦素蛋白受体的抗体。

图1 胰腺癌细胞中Ob-Rb表达情况

2.2 Ob-Rb对胰腺癌细胞迁移的影响

瘦素处理后，胰腺癌细胞相对迁移距离明显长于未用瘦素处理的胰腺癌细胞（P＜0.05）；Pearson相关性分析结果显示，r=0.623，P＜0.05。

图2 Ob-Rb对胰腺癌细胞迁移的影响

3.讨论

当胰腺中的细胞繁殖失控并形成肿块时，便会出现胰腺癌，它是所有胃肠癌中最恶性肿瘤之一，这些癌细胞具有侵染全身其他各部位的能力，因此具有低于6%的5年生存率。目前胰腺癌缺乏有效的治疗方法，在过去的几十年中，没有一种新方法能够帮助患者摆脱疾病或者增加生存几率[6]。有研究显示，肥胖和糖尿病是罹患胰腺癌独立危险因素，同时肥胖也与切除胰腺的胰腺癌患者淋巴结转移有关[7]。瘦素及其受体的失调对其他癌症（包括胃癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和结直肠癌等）的影响已有诸多报道，但瘦素及其受体表达水平与癌症之间的关系尚缺乏详细研究[8,9]。

本文研究发现，Ob-Rb全长1071bp，WB显示Ob-Rb识别瘦素蛋白受体的抗体，说明Ob-Rb能在胰腺细胞中表达，且是负责信号转导的功能性受体。瘦素处理后，胰腺癌细胞相对迁移距离明显长于未用瘦素处理的胰腺癌细胞，且Ob-Rb表达与胰腺癌细胞迁移距离之间Pearson相关性分析结果显示P值＜0.05，说明Ob-Rb表达能显著增加胰腺癌细胞迁移距离。在癌细胞中Ob-Rb的异常表达已被建议是在卵巢癌、乳腺癌和子宫内膜癌一个有用的预后标志物，虽然所对应病症不同，但其与本研究发现的作用结果一致[10]。

本研究这些发现为瘦素/Ob-Rb作为胰腺癌新型治疗靶点的提供了支持。但本研究的局限性在于，由于瘦素的分泌性质，我们没有在胰腺癌组织中使用免疫组织化学同时测试瘦素表达，后续实验需要确定瘦素及其受体对胰腺癌细胞的作用是通过什么分泌方式发挥。

综上所述，瘦素功能性受体Ob-Rb能在人胰腺癌细胞中表达，瘦素处理能增加胰腺癌细胞迁移距离且Ob-Rb表达与胰腺癌细胞迁移。