鲑鱼甲病毒逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法研究

刘艳华，任 彤，谈艳苗，张利峰

（北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心，北京 100026）

鲑 鱼 甲 病 毒（Salmonid alphavirus，SAV）隶属于披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（Alphavirus），是单股正链RNA病毒，基因组长11～12 kb，含有两个开放阅读框，具有5'端帽子和3'端polyA尾巴结构[1]。目前发现鲑鱼甲病毒有6种基因型（I、II、III、IV、V和VI型）[2]，主要感染大西洋鲑（Salmo salar）、虹鳟（Oncorhynchus raykiss）和褐鳟（S. trutta）等鲑科鱼类，引起鲑鱼胰脏病（Salmon pancreas disease，PD），主要表现为胰腺炎、心肌炎和昏睡等症状，其临床症状和死亡率受水温和季节的影响[3]。自1976 年首次在苏格兰养殖的大西洋鲑鱼中报道发现PD以来，该病已在北美地区，以及挪威、爱尔兰、法国和西班牙等欧洲国家被确诊，致死率为1%～48%[4]。随着冷水鱼类养殖的不断发展和国际贸易的增加，SAV 有继续扩散的趋势。2013 年世界动物卫生组织（OIE）将鲑鱼甲病毒病列入法定通报的水生动物疫病名录。目前，SAV的检测方法主要有细胞培养法[5]、ELISA方法[6]、RT-PCR[7]方法和RT-qPCR法[8]等。

为提高检测效率，本研究以SAV保守基因片段为模板，设计LAMP引物，建立了一种SAV特异性的逆转录环介导等温扩增（Reverse transcription loop-mediated isothermal ampli fi cation，RT-LAMP）检测方法。

1 材料与方法

1.1 病毒RNA

SAV RNA由东北农业大学动物科学技术学院提供。

传染性鲑鱼贫血病毒（Infectious salmon anaemia virus，ISAV）、病毒性出血性败血症病毒（Viral haemorrhagic septicaemia virus，VHSV）、传染性造血器官坏死病毒（Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV）、病毒性 神经 坏死 病 病 毒（Viral nervous necrosis，VNNV）、草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）、鲤春病毒血症病毒（Spring viraemia of carp virus，SVCV）的RNA均由本实验室分离并保存。

1.2 引物设计

以 SAV nsP1（GenBank：AY604238.1） 基因序列保守片段（181 bp）为模板，使用在线软件 http∶//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html 和DNASTAR primer select 设计出3对引物（表1）。引物由上海生工有限公司合成。

1.3 反应体系

表1 根据SAV nsP1基因片段设计的RT-LAMP引物

体系为25 µL：RNA模板5 µL，10×反应缓冲液（含MgSQ480 mmol/L和dNTPs 14 mmol/L）2.5 µL，MgSQ4（100 mmol/L）1.5 µL，引物组（含SAV-FIP/BIP各16 μmol/L，SAV-F3/B3各2 μmol/L，SAV-LF/LB 各 4 μmol/L）各 2.5 µL，Bst 2.0 DNA聚合酶（8 000 U/mL）1 µL，AMV反转录酶1 µL（10 000 U/mL），去离子水11.5 µL。

1.4 反应温度优化

以SAV RNA为模板，分别在58、59、60、61、62、63、64、65、67和 69 ℃ 下 进 行 RTLAMP反应。使用浊度仪LA-320C（Lanpu Biotech，China）读取扩增结果。

1.5 检测结果可视化

在1.3反应体系基础上，加入终浓度10 mmol/L的钙黄绿素，体系仍为25 µL。将PCR管放置于烘箱中，反应温度为1.4确认的温度，反应时间为1 h，85 ℃灭活 5 min。

1.6 反应产物克隆及阳性对照制备

使用TIANgel Midi Puri fi cation Kit（TIANGEN，China）胶回收试剂盒，回收纯化引物SAV-F3和SAV-B3的PCR扩增片段，再将片段连接入pGem-T-Esay载体（Novigen），连接产物转化入DH5α中进行蓝白斑筛选。挑选白色菌落提取阳性重组质粒pGem-T-SAV作为RT-LAMP检测用阳性对照。使用微量紫外分光光度计，对重组质粒溶液进行定量，并按照以下公式将重组质粒的质量浓度换算为拷贝数浓度：

拷贝数浓度（copies/mL）=质量浓度（g/mL）×6.02 × 1023/MW（g/mol）

1.7 检测限

根据测量和换算的浓度，将重组质粒pGem-T-SAV溶液稀释为1011copies/µL，再将该溶液以10 倍梯度稀释至 100、101、102、103、104、106、107copies/µL；每稀释度各取5 µL分别进行RTLAMP反应和RT-PCR反应。RT-LAMP反应使用1.5的反应体系和1.4确认的反应温度，RT-PCR反应使用OIE水生动物疾病诊断手册（2018）[9]推荐的RT-PCR检测方法进行。

1.8 交叉反应

以 ISAV、VHSV、IHNV、VNNV、GCRV、SVCV的RNA为模板，各取5 µL分别进行RTLAMP检测（反应体系和温度同1.7）。

2 结果与分析

2.1 反应温度优化

64、65和67 ℃组反应26 min左右出现扩增曲线，为最早出现曲线的反应组，但67 ℃组的曲线线形不好；其他组扩增曲线出现的时间较晚，69 ℃甚至显示阴性。这有可能是当反应温度超过65 ℃时，体系内的反转录酶活性降低，使目的基因扩增效率降低，导致RT-LAMP扩增曲线吸光值较弱，甚至未检测到信号。根据优化试验结果，为提高引物与模板结合的特异性，RT-LAMP的反应条件确定为65 ℃恒温反应1 h，85 ℃灭活5 min（图1）。

图1 SAV RT-LAMP反应条件优化

2.2 检测结果可视化

反应体系内加入钙黄绿素后，检测结果显示，SAV呈绿色，其他样品未变色（图2）。

图2 荧光RT-LAMP检测SAV

2.3 检测限

反应条件为65 ℃恒温反应1 h，85 ℃灭活5 min。随着样品模板量的递减，样品变色时间也逐渐延长，模板稀释到10个拷贝数，PCR 扩增1 h后的结果仍为阳性；模板稀释到100，即1拷贝数时，扩增1 h后的结果则为阴性。由此可得出RT-LAMP检测限为10个拷贝数的目的基因核酸片段（图3）。

图3 RT-LAMP检测限

相对的，RT-PCR检测结果，模板稀释到102个拷贝数，结果为弱阳性；模板稀释到10个拷贝数，结果为阴性。因此RT-PCR的检测限为102个拷贝数的目的基因核酸片段，RT-LAMP的检测限是RT-PCR的10倍（图4）。

图4 RT-PCR检测限

2.4 交叉反应测试

交叉反应测试结果表明，只有以SAV RNA为模板时，RT-LAMP的反应才呈阳性，而以其他病毒RNA为模板时，反应结果则呈阴性，说明建立的SAV RT-LAMP检测方法特异性良好（图5）。

图5 RT-LAMP交叉反应检测结果

3 讨论与结论

SAV对我国来说是一种外来鱼类疫病病原，目前尚未分离到。随着我国鲑科鱼类养殖面积的逐步增大[10]，以及国际鲑鱼进出口贸易量的不断增加[11]，该病毒的传入风险逐渐加大，因此必须加强针对SAV的检验检疫工作，避免SAV传入我国[12]。在鱼病的检测工作中，样品量往往非常大，导致检测时间较长。为减轻工作量、提高检测效率，需要在保证检测限和特异性的基础上，建立比传统的RT-PCR方法、RT-qPCR方法和免疫学方法更方便快捷的检测方法。

环介导等温核酸扩增（Loop-mediated isothermal ampli fi cation，LAMP）可在1 h内，将少量拷贝数的目的基因扩增至109～1010个拷贝数，反应产物不仅可以通过浊度仪、real-time PCR仪及凝胶电泳仪进行检测，而且还可以通过SYBR Green I、钙黄绿素、羟基萘酚蓝染色后，进行肉眼识别[13]。因此近年来国内外陆续建立了多种针对水生动物病毒的LAMP检测方法，如疱疹病毒II型[14]、传染性造血组织坏死病毒[15]、真鲷虹彩病毒（RSIV）[16]等。

本研究建立的特异性SAV RT-LAMP检测方法，将病原RNA的反转录与LAMP扩增反应集中于同一反应体系，在恒温条件下一次性完成扩增。相对于传统的方法，该方法主要有以下四点优势：一是耗时短。RT-PCR方法检测SAV，需要3 h左右，RT-qPCR方法需要2 h左右。该RT-LAMP方法省去了制备琼脂糖凝胶、电泳等过程，反应只需要1 h。二是恒温即可完成整个检测过程，不需要PCR仪或荧光定量PCR等设备，检测成本较低。三是检测限比目前通用的RT-PCR检测方法高10倍。四是无需打开反应管电泳，降低气溶胶扩散风险。作为一种高效的核酸扩增技术，打开反应管取样的过程中有一定气溶胶污染风险[17]，容易导致检测结果出现假阳性。该RT-LAMP检测技术使用钙黄绿色作为标记物，使阳性样品可显示肉眼可见的黄绿色，不需要打开反应管电泳等步骤，极大降低了气溶胶扩散的风险，可以有效避免核酸扩增结果出现假阳性[18]。

综上所述，本研究建立的SAV RT-LAMP检测方法，特异性强、检测限高、快捷经济、假阳性风险低，适合进出口鱼类大批量样品的临检工作。