皮肤瘢痕癌组织中MDM2的表达及意义

李 慧，胡成久*

（1．济宁医学院附属医院肿瘤科，山东济宁 272029；2．济宁市第一人民医院病理科，山东 济宁 272011）

皮肤瘢痕癌是一种在皮肤病理性瘢痕基础上，被覆上皮发生癌变的恶性肿瘤。好发于四肢，以鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)最常见，其次是基底细胞癌(basal cell carcinoma，BCC)。据报道烧伤瘢痕大约有2%发生癌变[1]，目前其发生机制尚不清楚。鼠双微体2(murine double minute 2， M DM2)是一种抑制细胞凋亡的癌基因，与肿瘤的发生发展密切相关。许多恶性肿瘤存在MDM2的高表达[2]。研究发现， M DM2基因异常能显著增加患非色素性皮肤癌的风险[3]。MDM2与皮肤病理性瘢痕癌变是否相关及作用机制，目前尚不清楚。本研究采用免疫组化法和RNA原位杂交技术，探讨MDM2蛋白和mRNA的表达与皮肤病理性瘢痕癌变的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

选取于2011年1月—2016年12月济宁市第一人民医院病理科的存档蜡块共45例。蜡块标本分为皮肤瘢痕癌、皮肤病理性瘢痕和正常皮肤3组。瘢痕癌为20例，从皮肤病理性瘢痕形成到癌变，时间长短不一，为3～21年，均为鳞状细胞癌；皮肤病理性瘢痕为15例，正常皮肤为10例。

1.2 主要试剂

鼠抗人MDM2单克隆抗体及二抗MaxVisionTM试剂盒，购于北京中杉金桥公司。MDM2 mRNA原位杂交试剂盒，购于武汉博士德生物公司。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组化染色法 食管癌组织为阳性对照，用PBS代替一抗为阴性对照。3组标本均4 μm切片，二甲苯脱蜡后水化，抗原修复，每张切片滴加20 μL MDM2抗体覆盖组织，4 ℃过夜，PBS缓冲液冲洗，滴加酶标二抗，室温20 min后冲洗，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。染色结果由病理医生在光镜下观察并进行判读。

1.3.2 RNA原位杂交技术 用预杂交液代替探针为阴性对照，阳性对照同上。标本采用6 μm切片，每张切片滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37 ℃消化30 min，PBS冲 洗 后 固 定10 min， 滴 加20 μL MDM2 mRNA探针，40 ℃杂交过夜，杂交后洗涤，滴加生物素化鼠抗地高辛，37 ℃、60 min，相继滴加SABC及生物素化过氧化物酶，DAB显色，其余步骤同上。光镜下判读染色结果。

1.4 结果判断

MDM2蛋白以细胞核和(或)胞质出现棕黄或棕褐色颗粒判定为阳性；MDM2 mRNA以细胞质出现棕黄颗粒判定为阳性。采用半定量积分法，根据每张切片的阳性细胞百分数和染色强度计分的乘积来判定。根据积分判定为4个等级：≤2分为阴性(-)，>2～3分为弱阳性(+)，≥3～6分为阳性(++)，≥6分为强阳性(+++)。

每张切片选取随机5个不同的高倍视野，运用计算机图像分析系统分别测出MDM2蛋白和mRNA阳性着色的平均光密度(opticai density，OD)和阳性面积与分析区域面积的比值(positive area/analysis area，PA)，OD值越大即表达强度越高，PA值越大即表达水平越高，各取其平均值并记录实验数据。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 MDM2蛋白的表达

免疫组化法检测MDM2蛋白表达，结果见图1。20例瘢痕癌标本中，14例强阳性，3例阳性，3例弱阳性；15例皮肤病理性瘢痕标本中，1例强阳性，9例阳性，3例弱阳性，2例阴性；10例正常皮肤标本中，7例阴性，3例弱阳性，弱阳性区仅见于基底层。

3组标本的表达强度OD值、表达水平PA值有显著性差异(FOD= 14.082， POD< 0.05； FPA= 10.419， PPA<0.05)，在正常皮肤组、皮肤病理性瘢痕组、瘢痕癌组中的MDM2蛋白表达逐渐升高，组间 两 两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，如表1所示。

A：在正常皮肤表皮中MDM2蛋白呈弱阳性表达；B：在皮肤病理性瘢痕上皮中MDM2蛋白呈阳性表达；C：在皮肤瘢痕癌中MDM2蛋白呈强阳性表达.

与正常皮肤组比较，**P<0.01；与皮肤瘢痕组比较， #P <0.01.

2.2 MDM2 mRNA的表达

RNA原位杂交法检测MDM2 mRNA表达，结果见图2。20例瘢痕癌组织标本中，15例阳性，4例弱阳性，1例阴性；15例皮肤病理性瘢痕标本中，1例阳性，12例弱阳性，2例阴性；10例正常皮肤标本中，9例阴性，1例弱阳性。

3组标本的MDM2 mRNA表达强度OD值、表达水平PA值差异显著(FOD= 16.009， POD< 0.05； FPA=20.819，PPA< 0.05)，在正常皮肤组、皮肤病理性瘢痕组、瘢痕癌组中的MDM2 mRNA表达逐渐升高，组间 两 两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。如表2所示。

图2 RNA 原 位杂交检测M DM2 mRNA 的 表达情况(× 4 00)

表2 MDM2 mRNA在 正常皮肤、皮肤病理性瘢痕和瘢痕癌中的表达(-x±s)

3 讨 论

MDM2是一种进化保守的癌基因，位于人染色体12q13~14区，其编码蛋白和抑癌基因 P 53之间通过负反馈调节环进行相互作用[4]。野生型P53能促进激活MDM2的转录功能，使MDM2蛋白合成增加及表达升高；同时，过表达的MDM2蛋白与野生型P53相互结合，阻碍了野生型 P 53基因的转录激活，使野生型P53蛋白合成减少并维持在低水平，显著降低其对肿瘤的抑制作用。另外，MDM2还能够通过激活E2F1促进细胞G1→S期的转变，加快细胞周期的循环[4-5]。因而， M DM2作为癌基因，既能增强肿瘤细胞的生存活力，又能促进肿瘤细胞的增生和生长。许多恶性肿瘤的发生与发展和癌基因 M DM2的作用相关[5]。Michalk等[6]对127例食管鳞状细胞癌采用定量PCR技术进行检测后发现，其中23例存在 M DM2基因的扩增和表达；Li等[7]通过药物减少小鼠皮肤黑色素瘤中MDM2的表达，与对照组比较，MDM2低表达抑制了肿瘤的生长；Wang等[8]运用腺病毒载体介导 M DM2基因沉默，使皮肤鳞状细胞癌的增殖得到有效控制，同时诱导了肿瘤细胞的凋亡。

本研究发现，正常皮肤组MDM2蛋白的表达为阴性或弱阳性，皮肤病理性瘢痕组MDM2蛋白的表达为阳性，瘢痕癌组MDM2蛋白的表达为强阳性；正常皮肤组MDM2 mRNA的表达大部分为阴性，皮肤病理性瘢痕组MDM2 mRNA的表达为弱阳性，瘢痕癌组MDM2 mRNA的表达为阳性。在正常皮肤、皮肤病理性瘢痕及瘢痕癌共3组样本的 m RNA水平和蛋白水平中，MDM2 均显示出表达强度、表达水平的逐渐升高趋势；瘢痕癌组分别与皮肤病理性瘢痕组、正常皮肤组相比较，均显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)。提示瘢痕癌的发生可能与MDM2、MDM2 mRNA的持续高表达有关。可能的机制为 ， MDM2的持续高表达阻遏了野生型 P 53基因的转录激活功能，并使野生型P53蛋白表达水平维持在低水平，同时，MDM2通过促进细胞G1向S期的转变使细胞周期的循环加速，异常细胞生存延长及增殖失控，导致瘢痕癌变及肿瘤的发生。

同时，皮肤病理性瘢痕组MDM2蛋白、MDM2 mRNA的表达水平均高于正常皮肤组，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示病理性瘢痕可能是一种癌前病变，检测MDM2蛋白、MDM2 mRNA水平有可能作为一个早期指标，预测皮肤病理性瘢痕癌变。