抗酸杆菌自动荧光染色和显微镜扫描技术在结核病诊断中的临床评价

李强 杨红国 邓云峰 欧喜超 夏辉 赵雁林

结核病是全球范围内传染病的第二大死亡原因，仍是全球主要的公共卫生问题；根据世界卫生组织的报告，近3年来全球结核病患者从900万例上升到1040万例；中国是结核病高负担国家，每年约有100万例患者被诊断为结核病[1]。肺结核及时准确的诊断可迅速启动治疗，减少社区传播。

抗酸杆菌(AFB)痰涂片显微镜镜检仍是中低收入国家结核病诊断的重要方法。在中国，近3000个县级实验室使用显微镜检查诊断肺结核[2]。然而，传统的显微镜依赖于人工检查，检测的敏感度差异较大[3]。1名熟练的技术人员对1份标本要花费至少5 min来检查显微镜下萋-尼染色涂片的300个视野。此外，技术人员在阅读几张涂片后通常很容易产生视觉疲劳。为保证显微镜检查的质量，1名工作人员不能连续检查25张涂片[4]。荧光显微镜检查(FM)镜下视野小，仅需要检查50个视野，可以缩短阅片时间。因此，FM在工作量大的实验室得到广泛应用，以减轻实验室工作人员的工作强度。此外，FM较萋-尼染色显微镜检查的敏感度高[5]。

在过去的20年中，许多科学家致力于开发自动显微镜阅读系统，以加快阅片时间，减少其对技术人员的依赖[6-7]。基于图像分析的自动显微镜检查技术取得一定的进步[8]，其步骤通常包括自动聚焦、图像捕获、图像分割和对象分类[9]。自动荧光染色和显微镜扫描技术(AFSS)由自动染色机和自动扫描显微镜系统组成(上海皓信)。显微镜受计算机控制，由电动机驱动。该系统有4种类型的模块，包括单片机和多片机，可供不同工作量实验室选择。AFSS扫描每个涂片需要2 min。每一个包含AFB的视野将被保存用于人工复核。在数据库分析的基础上，计算机通过扫描涂片视野，给实验人员展示一个阳性或阴性结果的典型图像。为了解AFSS 在地市级医院的临床表现，笔者在临沂市人民医院开展了本项研究。

材料和方法

1.标本来源：2016年9—12月，连续纳入临沂市人民医院门诊就诊的748例肺结核可疑症状者。747例留取3份痰标本，1例留取2份痰标本，共计有2243份标本用于本次研究的实验室检查。

2.涂片检查：每一份痰标本制作2张涂片， 1张用于传统荧光染色显微镜检查， 采用40×物镜。分级标准如下：阴性 (0条AFB/50 视野)； 实际条数 (1～9 条AFB/50 视野)； + (10～49条 AFB/50视野)； ++(1～9条 AFB/视野)；+++(10～99条 AFB/视野)；++++ (≥100 条AFB/视野)[10]。

3.自动染色涂片扫描：同时采用另外1张涂片进行AFSS自动染色和显微镜扫描。

4.培养：每份痰标本取2 ml痰液用4% NaOH按照 1∶1体积比例混合消化15 min，每个罗氏固体培养基接种0.1 ml，37 ℃恒温培养箱培养8周[11]。9份样本罗氏固体培养发生污染，共计2234份样本获得培养结果。

5.质量控制：为保证质量，每个技术人员在项目研究开始前参加统一技术培训，培训后开展1周现场预实验。预实验期间，所有痰涂片需由1位工作人员应用萋-尼染色法复核[10]。研究现场实验室平时常规接受上级实验室进行的质量控制检查。

6.统计学处理：所有数据录入Excel表格，数据分析使用SPSS 22.0统计学软件，不同方法检出率的比较采用卡方检验，以P<0.05为有统计学意义。

结 果

一、 AFSS和传统FM阳性率分析

AFSS检测阳性率为32.1%，略高于传统FM显微镜检查31.9%阳性率，但差异无统计学意义 (P>0.05) ，见表1。

二、AFSS和传统FM检测结果对比分析

AFSS和传统FM检测总体一致率为97.1%(2177/2243)，66份样本检测结果有差异。 31份样本传统FM检测为阳性而AFSS检测为阴性，占AFSS检测阴性的2.0% (31/1523)， 其中，5份样本传统FM检测结果为高阳性级别 (+++和++++)。35份样本AFSS检测阳性而传统FM检测为阴性，约占传统FM检测阴性的2.3% (35/1527)，其中，91.4% (32/35) 的样本AFSS检测结果为低阳性级别 (实际条数和+)，见表2。

三、AFSS及传统FM检测不一致者与培养结果的比较分析

与培养结果相比较，AFSS检测阴性而传统FM检测阳性的样本中， 96.8% (30/31) 培养阳性；AFSS检测阳性而传统FM检测阴性的样本中，54.3% (19/35) 培养阳性(表3)。AFSS检测阳性而传统FM检测阴性且培养阳性的16份样本， AFSS 检测结果均为低阳性级别(实际条数和+)，其中4份样本萋-尼染色复核镜检结果为阳性。

表1 2243份痰标本采用AFSS和传统FM检测的阳性率比较

表2 AFSS和传统FM检测结果对比分析 (份)

表3 AFSS及传统FM检测不一致者与培养结果的比较分析 (份)

注a：AFSS检查有6 份标本检测结果为实际条数，9份为+，1份为++；b： FM检查有4 份为+++，1 份为++++

表4 以罗氏固体培养为标准，AFSS和传统FM检测分枝杆菌的效能分析

注表中括号内数值为“95%CI值”。以痰培养(罗氏固体培养)为标准，分别计算AFSS、传统FM检测的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。计算公式如下：敏感度=真阳性数/(真阳性数+假阴性数)×100%；特异度=真阴性数/(真阴性数+假阳性数)×100%；一致率=(真阳性数+真阴性数)/(真阳性数+假阴性数+真阴性数+假阳性数)×100%，阳性预测值=真阳性数/(真阳性数+假阳性数)×100%；阴性预测值=真阴性数/(真阴性数+假阴性数)×100%

4. AFSS和传统FM检测分枝杆菌的效能分析

与固体培养为标准，AFSS检测分枝杆菌的敏感度和特异度分别为83.4%和95.9%，阳性预测值和阴性预测值分别为91.6%和91.4%。60份AFSS 阳性而培养阴性的样本中，46份样本萋-尼染色阳性。131份AFSS阴性而培养阳性样本中，46份样本萋-尼染色阳性。传统FM检测分枝杆菌的敏感度和特异度分别为84.8%和96.9%。45份传统FM阳性而培养阴性样本中，43份样本萋-尼染色结果为阳性。120份传统FM检测阴性而培养阳性样本中，29份样本萋-尼染色结果为阳性，AFSS 和传统FM效能分析见表4。

讨 论

研究报道，荧光染色显微镜镜检的敏感度高于萋-尼染色镜检方法[12]。2011年，世界卫生组织推荐LED荧光显微镜检查可用于替代传统萋-尼染色方法[13]。本研究结果显示，传统荧光显微镜检查阳性率为31.9%；AFSS阳性率(32.1%)略高于传统荧光显微镜检查，但差异没有统计学意义 (P>0.05)。AFSS和传统荧光显微镜检查总体一致率为 97.1%，尽管传统荧光显微镜检查可以检出更多高阳性级别样本，但AFSS可以检测出更多的低阳性级别样本。

本次研究中，AFSS和传统荧光显微镜检查共有66份样本检测结果不一致，占总样本量的2.9%。35份传统荧光显微镜检查阴性样本AFSS检测为阳性，占传统荧光显微镜检查阴性结果的2.3%。这些样本中，90%以上样本AFSS检测结果为+或实际条数，54.3%的样本最终培养结果为阳性。另外31份AFSS阴性样本传统荧光显微镜检查为阳性，这些样本几乎全部培养阳性。不同检测方法产生不一致检测结果可能有几个方面原因：首先，临床上收集的痰标本性状不均匀，制作涂片时，仅取少量痰样本，容易导致取样差异。因此，痰涂片制作过程中取样差异是造成检测结果不一致的最主要原因。其次，与涂片显微镜不同，固体培养的关键问题是样品中存在活细菌。相反，细菌的活力对涂片镜检的结果没有影响。最后，不同检测方法检测原理不同，可能也是导致检测结果不一致的原因。

作为一种筛查工具，特异度较敏感度更为重要，可避免漏诊可疑患者。本研究结果显示，AFSS特异度为95.9%，高于其他研究报道的自动化检测系统[14]。131份AFSS检测阴性样本培养为阳性，其中46份样本萋-尼染色复核为阳性。120份传统荧光显微镜检查阴性样本培养为阳性，其中29份样本萋-尼染色复核为阳性。此外，60份AFSS检测阳性样本培养结果为阴性，45份传统荧光显微镜检查阳性样本培养为阴性。AFSS阴性预测值为91.4%，可能会漏掉8.6%的培养阳性样本；而传统荧光显微镜检查阴性预测值为92.1%，可能会漏掉7.9%的培养阳性样本。结果提示，AFSS可能会漏掉一些肺结核患者，检测技术需要做进一步改进。尽管AFSS检测技术和传统FM检测的阳性率差异无统计学意义，但AFSS是自动化检测技术，能够节省更多的实验室人员去开展其他工作，可以提高临床实验室的工作效率。

本研究结果表明，AFSS检测的阳性率及检测效能等效于传统FM检测技术，在工作量大的实验室、特别是人员缺乏的实验室，AFSS检测技术可以作为传统FM检查的替代工具。

志谢临沂市人民医院实验室技术人员及相关部门人员在患者纳入、实验室检测和数据录入方面进行了大量工作。