交叉引物恒温扩增检测技术在疑似肺结核患者临床诊断中的价值

欧喜超 董海燕 夏辉 王胜芬 屈燕 赵冰 张治英 赵雁林

2017年WHO[1]报告估算全球共有1040万例结核病新发患者，平均发病率为140/10万，我国肺结核发病患者例数居第三位，仅次于印度和印度尼西亚。在2016年全球登记的540万例新发和复发的肺结核患者中，有57%经细菌学证实，其余患者根据其症状和胸部影像学检查结果等被诊断为肺结核。目前，我国细菌学确诊患者仅占31%；“十三五”全国结核病防治规划明确提出，到2020年，要将确诊肺结核患者的病原学阳性率提高到50%以上。因此，为确保就诊患者能够获得准确、可靠、及时的实验室诊断结果，亟需加强结核病实验室服务水平[2]。

高质量的实验室服务是实现对结核病患者进行正确诊断和治疗的一个重要组成部分，为提高我国结核病实验室的诊断能力，国家卫生健康委员会与比尔及梅琳达·盖茨基金会合作开展了若干评估新型结核病诊断工具的项目[3-5]，以期提高我国基层实验室结核病患者的检出率。笔者根据前期评估结果，选用经济、有效、易用的交叉引物恒温扩增(cross-priming isothermal amplification, CPA)检测技术[6-8]，进一步扩大样本量，进入地市和县(区)级结核病实验室开展示范应用的可行性研究，验证CPA检测技术在县(区)级结核病防治机构用于结核病诊断的可行性，并比较不同诊断技术组合对于提高活动性肺结核患者病原学检测阳性率的影响。

材料和方法

1.研究对象：以2016年1—10月在广东省佛山市结核病防治所、江门市结核病防治所、南海区疾病预防控制中心、三水区疾病防治所、新会区结核病防治所、开平市结核病防治所、台山市结核病防治所、鹤山市慢性病防治站和恩平市慢性病防治站就诊的疑似肺结核患者为研究对象，研究期间共纳入6524例疑似肺结核患者，排除15例培养污染和2例CPA检测无效，共6507例患者纳入分析。由接受过培训的临床医生详细询问纳入患者的一般信息、本次就诊症状及病史，逐项确认后填写临床信息表。纳入患者均进行胸部影像学检查，并送检痰标本到实验室进行涂片镜检、固体培养和CPA检测，实验室对培养阳性菌株进行菌种鉴定(图1)。

2.胸部影像学检查：(1)成年人摄胸部正位X线片1张。(2)0～14岁儿童肺结核可疑症状者，先进行结核菌素皮肤试验，强阳性者摄胸部正位X线片1张；胸部正位X线片显示异常，则加摄1张X线侧位片。

3.痰涂片检查：涂片镜检遵照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[8]中的标准化操作程序执行。

4.分枝杆菌分离培养和菌种鉴定：固体培养试验遵照《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》[9]中的操作要求执行。对于培养阳性标本，实验室人员选取生长状态最好的阳性培养管，按照结核分枝杆菌抗原检测试剂盒说明书的要求进行菌种鉴定。

5.CPA检测：实验室人员收到痰标本后，优先选取疑似肺结核患者的晨痰(无晨痰时可选夜间痰)进行CPA检测，按照EasyNATTM结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(恒温扩增-试纸条法)说明书的要求进行检测。

6.诊断：临床医生根据实验室检查、胸片和临床检查结果等对纳入患者进行综合诊断，患者最终被诊断为涂阳肺结核、分子检测阳性肺结核、仅培阳肺结核、临床诊断肺结核和排除肺结核，培养与菌种鉴定结果用于纠正患者初诊诊断结果，菌种鉴定结果为非结核分枝杆菌纠正患者诊断为“排除肺结核”；菌种鉴定结果为结核分枝杆菌且初诊诊断“排除肺结核”纠正患者诊断为“仅培阳肺结核”。诊断流程见图2。全部纳入患者完成后，国家级临床专家对菌阴临床诊断为肺结核患者和CPA阳性排除肺结核患者的诊断结果进行现场复核，国家级临床专家复核后的诊断结果为最终诊断结果。

7.统计学处理：使用SPSS 17.50软件，采用卡方检验对不同检测方法的阳性检出率进行比较分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、初诊疑似肺结核患者实验室检测及临床诊断结果

图1 疑似肺结核患者临床及实验室检查流程图

图2 患者诊断流程图

在纳入分析的6507例初诊疑似肺结核患者中，涂片阳性1187例，涂片阳性率为18.2%；培养阳性1629例，培养阳性率为25.0%；CPA检测阳性1555例，CPA检测阳性率为23.9%，CPA检测阳性率与培养阳性率差异无统计学意义(χ2=2.277，P>0.05)。3199例(49.2%)患者最终经临床诊断为活动性肺结核，3308例(50.8%)患者排除肺结核。

二、 活动性肺结核患者中涂片、培养和CPA联合检测结果

在3199例活动性肺结核患者中，涂片联合培养检测阳性患者1550例，检测阳性率为48.5%(1550/3199)；涂片联合CPA检测阳性患者1531例，检测阳性率为47.9%(1531/3199)；两种联合检测结果的阳性检出率差异无统计学意义(χ2=0.226，P>0.05)。涂片、培养和CPA三种方法联合检测时，检测阳性患者1740例，检测阳性率为54.4%(1740/3199)，除新会和鹤山外，其他7家单位活动性肺结核患者中病原学阳性率均达到50%。详见表1。

三、 痰涂片、固体培养和CPA检测诊断结核病的效能

以临床诊断结果为标准，痰涂片诊断结核病的敏感度和特异度分别为35.0%和98.0%；固体培养诊断结核病的敏感度和特异度分别为46.4%和95.7%；CPA检测诊断结核病的敏感度和特异度分别为44.6%和96.2%，见表2。

讨 论

一、CPA检测技术在县(区)级结核病防治机构的推广应用价值

在我国县(区)级结核病定点医疗机构，结核病的病原学诊断仍主要依靠涂片镜检。涂片镜检简单、快速、特异度高、成本低廉，但敏感度较低，每毫升标本中含量在5000～10 000条菌以上才能检出。结核分枝杆菌培养检查是目前结核病诊断的“金标准”，如患者标本通过培养试验分离出结核分枝杆菌，可确诊为结核病并具有传染性。但是培养试验用时较长，每周都需要观察培养结果，至少需要1个月左右的时间才能获得结果，操作过程中需要严格控制标本前处理时间，对实验人员的操作水平要求较高，并且培养阳性菌株还需要进行后续的菌种鉴定，才能确定患者是否感染结核分枝杆菌。之前已有研究表明[10-11]，在县(区)级结核病防治机构，采用CPA检测疑似肺结核患者的痰标本是否含有结核分枝杆菌，CPA检测结果报告时间比罗氏培养大大缩短，在不到1 d的时间内即可报告实验结果，且具有较高的检测效能。本研究通过以临床诊断结果为标准，发现CPA检测的敏感度明显高于涂片镜检，与固体培养试验相当。且CPA检测不需要PCR仪等特殊仪器设备，只需要水浴锅或金属浴在63 ℃恒温条件下就可实现靶核酸的扩增，实验人员通过肉眼观察试纸条上的条带进行结果判读，操作简单方便；同时通过玻璃化技术保障扩增试剂可以在常温下运输，不需要冷链运输。因此，CPA检测技术适合在县(区)级结核病实验室中推广应用。

表1 不同项目点临床最终诊断为活动性肺结核患者的涂片、培养和CPA联合检测结果

表2 以临床诊断结果为标准对涂片、培养和CPA检测诊断结核病的效能分析

注敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%

二、CPA检测技术在提高确诊肺结核患者病原学阳性率中的作用

临床上对肺结核患者的诊断仍存在一定的困难,常有过诊或漏诊发生，给结核病的防治工作带来不利影响。2016年全球登记的540万例肺结核患者(包括新发和复发患者)，只有57%的患者经过细菌学验证(如痰涂片、培养阳性，WHO推荐的快速诊断技术如GeneXpert MTB/RIF检测阳性等)。剩下的43%尚未进行细菌学确诊的患者都是根据临床诊断结果最终确诊(如症状体征、胸片检查发现异常，或组织学检查结果提示)。随着结核分枝杆菌病原菌和宿主的不断变化，结核感染患者的症状体征越来越不典型，部分患者无明显症状，因此越来越多的学者认为肺结核的诊断应以细菌学实验室检查为主，结合胸部影像学、流行病学和临床表现进行综合诊断。本研究在县(区)级结核病防治机构示范应用了CPA检测技术，证明其能很好地对传统的实验室检测方法进行补充。当单独使用涂片、培养和CPA检测时，活动性肺结核患者中病原学检测阳性率均低于50%；当联合涂片和CPA检测时，活动性肺结核患者中病原学检测阳性率明显提高，阳性检出率达到47.9%；3种方法联合检测的阳性率则达54.4%。这一结果也表明，CPA检测联合传统的涂片镜检和固体培养试验在县(区)级医疗机构用于结核病的诊断可显著提高活动性肺结核患者中的病原学阳性检出率。

三、小结

以临床诊断结果为标准，CPA检测技术的敏感度高于涂片镜检，与固体培养试验相当，但能明显缩短疑似肺结核患者的确诊时间。县(区)级结核病防治和定点医疗机构可应用CPA检测技术代替固体培养用于疑似肺结核患者的诊断。有条件的实验室可以采用多种诊断技术联合应用，进而提高活动性肺结核患者的病原学检测阳性率。

志谢比尔及梅琳达·盖茨基金会对本研究给予了大力支持。美国帕斯适宜卫生科技组织(PATH)在项目设计、实施和数据分析过程中给予了协助。广东省结核病控制中心、佛山市结核病防治所、江门市结核病防治所、南海区疾病预防控制中心、高明区慢性病防治站、三水区疾病防治所、新会区结核病防治所、开平市结核病防治所、台山市结核病防治所、鹤山市慢性病防治站和恩平市慢性病防治站的实验室和项目管理人员在项目实施过程中给予了各方面的支持和帮助。