国内外结核病预防用卡介苗质量标准比较

赵爱华 王国治 付丽丽 徐苗

卡介苗是目前唯一可用的能预防结核病的疫苗[1]，在我国是计划免疫疫苗，1978年即纳入国家免疫规划，《国家免疫规划儿童免疫程序及说明(2016年版)》要求新生儿出生时接种。因此卡介苗是接种者年龄最小的疫苗，同时也是接种后异常反应报道较多的疫苗[2-3]。国内目前供应计划免疫用卡介苗的生产企业为上海生物制品研究所有限责任公司和成都生物制品研究所有限责任公司。两家企业年获得签发总量约5千万人份，每年约有1千万名儿童接种卡介苗。近年来，联合国儿童基金会(UNICEF)每年卡介苗需求量超过1亿人份，主要由日本、丹麦、保加利亚等国家的卡介苗生产企业提供，其他国家如俄罗斯、巴西则主要供应本国使用。

随着人们对国产疫苗有效性与安全性的日益关注，部分民众认为进口疫苗优于国产疫苗，那么国产卡介苗与国外卡介苗在质量标准上是否有差异？笔者仅对国内外卡介苗生产与质量控制的标准进行简要的分析比较，以便了解中国与国际上卡介苗质量控制研究与发展的概况，供同行参考。

我国卡介苗质量标准概况

制定疫苗质量规程的目的是保证生产疫苗的质量，确保疫苗安全、有效。针对计划免疫用疫苗，世界卫生组织(WHO)也会发布相关建议，供世界各国参考，对于卡介苗质量其最新技术规范(WHO TRS 979)于2013年发布[4]，主要质量控制(简称“质控”)内容包括种子批质控、生产过程质控及成品质控。我国卡介苗质量标准参考《中国人民共和国药典(2015年版)》[5]，同时执行皮内注射用卡介苗2个局颁标准，分别为国家食品药品监督管理局注册标准WS 4-(ZB-010)-2010和WS 4-(ZB-004)-2010，也是上海与成都生物制品研究所有限公司的企业注册标准，2个国家局颁布标准质控项目与药典项目完全一致。我国卡介苗质量标准基本涵盖了世界卫生组织建议的相关内容，下面具体分析种子批质控、生产过程质控及成品质控方面与欧洲药典[6]的差异。

一、种子批质控的差异

对于种子批质控，WHO卡介苗推荐项目包括鉴别试验、3项安全性试验(细菌和真菌污染检查、无有毒分枝杆菌试验、过度皮肤反应试验)，1项效力试验(迟发超敏反应)、1项菌株特性试验(抗生素敏感性)，共6项。我国药典含鉴别试验、3项安全性试验(纯菌检查、毒力试验、无有毒分枝杆菌试验)，1项效力试验(免疫力试验)，共5项。欧洲药典仅鉴别试验与2项安全性试验项目(细菌和真菌污染检查、无有毒分枝杆菌试验)，共3项。主要差异在于效力试验欧洲药典不涉及，WHO推荐采用细胞免疫反应标志的结核菌素迟发超敏反应作为效力指标，中国药典采用结核分枝杆菌攻毒后BCG免疫动物脏器荷菌量的降低作为效力指标。结核菌素试验是无论结核分枝杆菌感染、卡介苗接种或非结核分枝杆菌感染都显示阳性的试验，一是无特异性，二是该指标为非疫苗诱导抗结核保护力的直接指标，只能提示卡介苗免疫成功。而中国药典采用的动物抗结核分枝杆菌攻击的评价方式能直接显示种子批诱导的抗结核免疫力水平，多年来给更换的种子批进行的保护力评价，结果基本一致[7]。另外欧洲药典9.0版是从2017年开始执行，对于WHO建议的抗生素敏感性试验，虽然未列入种子批项目，但也要求对该项进行评价。我国药典尚未设置该项检测；但中国食品药品检定研究院(简称“中检院”)的评价结果显示，我国卡介苗菌种的抗生素敏感性与其相同来源的丹麦菌种(BCG Danish1331)一致(数据待发表)。具体的国内外种子批质控项目差异见表1。

二、生产过程质控项目的差异

对于生产过程的质控，WHO卡介苗推荐项目包括浓度测定、活菌数测定，还包括2项安全性试验(细菌和真菌污染检查、无有毒分枝杆菌试验)，共4项。欧洲药典与我国药典均不在生产过程中涉及无有毒分枝杆菌试验。

众所周知卡介苗的不良反应与疫苗本身的浓度、均匀度与活菌量有关。卡介苗的生产首先是菌种复苏，其次是菌体传代扩大培养，以收集足够的菌体用于菌液的制备。但由于卡介苗的疏水特性，因此其培养的菌体浮于液体培养基的表面，形成一层菌膜，收集菌体后需要将这些菌膜研磨成小的菌块，形成均匀的菌液后再稀释分装。若收集的菌体研磨不均匀，则会导致制品中含有大量的菌块，临床接种后可能导致不良反应风险的增加。因此，我国药典设置了沉降率项目，通过评价沉降率大小，间接了解菌液的均匀性。同时与浓度指标、活菌数指标同时控制，避免由于菌块过大、菌体过多、活菌数过高而导致的临床接种不良反应，这是在生产过程中从疫苗因素本身来避免发生临床不良反应的质控措施。我国药典在半成品项下还设置了活力测定项目，主要基于卡介苗半成品至成品分装周期短，同时活菌数检测周期需要4～5周的现状，采用生物化学方法短时间内获得制品的活菌状况。WHO推荐规范仅将该项目置于成品项下(表1)。

三、成品质控项目的差异

对于成品质控，WHO推荐项目含9项，欧洲药典5项，中国药典8项，但具体检测项目中国药典有10项。国外药典与中国药典主要的质控项目的差异在于过度皮肤反应，该项目同样涉及种子批的检定，并说明工作种子批及来自本工作种子批连续五批或三批成品该项检测结果均合格，则成品此项检测可省略。推测设置该项目的目的可能是考察菌种及其所制备疫苗接种后导致不良反应的程度。中检院曾对我国卡介苗生产用工作种子批，国内两家卡介苗企业生产的47批疫苗成品进行了该项目的检测，结果发现我国皮内注射用卡介苗菌种工作种子批和成品的过度皮肤反应直径及活菌数与国家参考品无差异；同时我国卡介苗制品的过度皮肤反应程度也低于国外疫苗制品，推断过度皮肤反应与菌种、浓度、均匀度及活菌数都有关；在确定菌种的情况下，可能与疫苗制造过程中颗粒大小的均匀度、浓度及活菌数的关联性更大；我国卡介苗生产规程通过对浓度、沉降率、活菌数的控制，可以从生产过程中控制成品引起皮肤反应的程度。因此，过度皮肤反应试验目前在我国卡介苗生产规程中设置的意义并不大。

表1 国内外卡介苗质控项目的差异

注“-”代表该药典或规范中不做此项检定

卡介苗是活菌疫苗，活菌易受到环境温度的影响而导致活菌数改变，进而影响疫苗的质量；因此，要对制品进行热稳定性试验，以评价疫苗的稳定性。我国热稳定标准为25%，即在37 ℃条件下放置28 d进行加速破坏试验样品的活菌数与2～8 ℃保存的同一批疫苗活菌数比较不得低于25%，并不得低于2.5×105菌落形成单位(CFU)/mg。国外的热稳定标准为20%[5]。我国药典对卡介苗质量标准中关于卡介苗活菌数仅设置了下限，即不低于1.0×106CFU/mg。而目前企业设置的放行标准在2.0×106CFU/mg以上；检定机构在疫苗上市前的批签发过程中，设置上下警戒限在2.0×106CFU/mg～8.0×106CFU/mg ，以确保制品的批间一致性。

通过上述国内外卡介苗质量标准的比较，可见WHO技术规范(WHO TRS 979)推荐更多的安全性检测，但从项目设置中国药典涵盖了世界卫生组织的技术规范(WHO TRS 979)的大部分内容，而欧洲药典则相对较少。

我国卡介苗菌种概况

菌种是影响卡介苗有效性与安全性的最主要因素，卡介苗是一株牛分枝杆菌经过13年230余代连续培养获得的减毒株，自1921年应用于人体后，卡介苗原始菌株被分发到全球各地，经不同实验室、不同传代方式，形成了培养特性、遗传特性各不相同的10余种疫苗生产株。国际上应用较多的疫苗生产用菌种包括，法国巴斯德株(BCG Pasteur 1173 P2)，丹麦1331株(BCG Danish 1331)，巴西株(BCG Mearou-RJ)，俄罗斯株(BCG Moscow 368)，保加利亚株(BCG Sofia SL 222)和日本172株(BCG Tokyo-172-1)等。我国现用卡介苗生产用菌种，源自1948年引进的共传了823代的丹麦菌种(BCG Danish 823)，该菌株经北京、上海、兰州培养后发生变异，形成上海D2株、北京D1株及兰州株(D2L)等，其中上海D2株于1974年12月29日冻干保存，称为BCG D2 PB302SⅡ甲10菌株，即现在计划免疫卡介苗的生产株，1993年全国统一使用BCG D2 PB302SⅡ甲10菌株生产卡介苗。

一、我国卡介苗菌种遗传学特性与国外菌种的差异

国际上不同卡介苗亚株的遗传特性各不相同[8]，我国卡介苗菌种为BCG Danish 823 传代菌种，与目前广泛应用的BCG Danish 1331在遗传学特性上有差异。我国卡介苗菌种同所有其他卡介苗亚株相同，都特异性缺失卡介苗在减毒过程中的缺失序列RD1，与BCG Danish 1331一样都缺失RD2，不缺失RD8、RD14、RD16、nRD18，含有一个IS 6110插入序列，但不同于BCG Danish 1331，含有RDDenmark/Glaxo 序列；SenX3-RenX3 基因座有3个串联重复序列，而BCG Danish 1331 含有2个或3个串联重复序列[9-10]，同时我国菌种与BCG Pasteur 1173 P2及BCG Tokyo-172-1有更明显的差异,其中日本株中含有2个亚型[11]。

从丹麦株和日本株的遗传学检测结果可以了解其菌株中含2个亚型，说明菌种不均一。早在20世纪70年代，Dam 等[12]就指出虽然各国制造BCG菌株均来源于法国巴斯德研究所，但由于当初的菌株不是采自单株菌落，而是混合菌落，因此使各菌株间在免疫力及减毒方面不可避免地会有一定程度的差异，同时也说明了传代对菌株的影响。目前，世界上的上市疫苗的菌种均是复合菌种；为减少传代代次对卡介苗效力的影响，并且使卡介苗疫苗生产管理更规范化，应该了解复合菌种与其中的不同单细胞克隆菌种在保护力方面的差异。2009年中国食品药品检定研究院将我国早期1956年冻干的卡介苗菌种进行复苏并扩增传代，其国内外总计传代944代，2014年以微孔滤膜方式从中制备单细胞克隆系列共5株，根据单细胞克隆菌落的培养特性与遗传学特性，进行动物抗结核感染的保护效果筛选，获得目前唯一的一株单细胞克隆生产用菌种，由该菌种生产的卡介苗已获得药物临床批件。

二、我国卡介苗菌种动物保护力与国外菌种的差异

尽管卡介苗已经有百年应用历史，但迄今缺少系统的、不同卡介苗菌株人体保护力的比较研究资料；在无人体使用效果的相关数据情况下，动物保护力成了菌株保护力的主要评价标准依据。

早在20世纪50年代，我国就在开展的卡介苗菌种筛选工作中，比较了我国卡介苗与国外菌株动物保护力的差异。选择卡介苗免疫后感染结核分枝杆菌的小鼠存活率为评价指标，评价了包括上海 D2株、北京D1株、巴西株、巴斯德株、苏联株、匈牙利株在内的8株卡介苗菌株。结果显示上海 D2株保护效果最佳，保护力优于其他菌株，平均存活率为56.0%，匈牙利株保护力最低，平均存活率仅16.0%[13]。

近年又采用豚鼠模型评价我国的BCG D2 PB302与丹麦株(BCG Danish 1331)、巴斯德株(BCG Pasteur 1173 P2)、布拉格株(BCG Prague)及匈牙利株(BCG Hungary)的动物保护力差异， 结果与20世纪50年代的结果一致，匈牙利株的保护力最低，而BCG D2 PB302呈现优良保护力，与BCG Danish 1331、BCG Pasteur 1173等其他亚株保护效果基本一致。该实验与早期小鼠模型试验间隔近60年，但结果完全一致[14]。

我国卡介苗接种现状

由于《预防接种工作规范(2016年版)》并不要求进行PPD阳转率的卡介苗免疫效果评价[15]，因此我国并无大规模卡介苗接种效果考核数据。根据文献报道，我国卡介苗接种覆盖率高，可达90%以上，接种3个月后PPD阳转率通常达90%，甚至95%[16-18]；说明我国卡介苗接种后能诱导很好的免疫反应；同时在技术熟练的接种人员进行操作的情况下，不良反应也并不常见。笔者参与的一项对近3万名新生儿进行卡介苗接种的临床研究显示，接种人员经过培训后接种，PPD阳转率高达97%，发生不良反应者仅19例，其中11例为卡介苗特异性的淋巴结反应[19-20]。根据我国多年来疑似预防接种异常反应(adverse events following immunization，AEFI)的监测数据显示，我国卡介苗淋巴结反应发生率为15.1/100万剂～54.43/100万剂[21-23]，低于WHO估测的卡介苗化脓性淋巴结炎发生率范围(1/万～10/万)[24]。

小 结

以上分析可见，我国有自己的卡介苗生产用菌种；我国卡介苗动物保护效果与国际常用菌株基本一致；有可以生产卡介苗的生产企业，能自主生产并提供每年5千万人份的疫苗。我国卡介苗质量标准对控制产品与不良反应相关的安全性标准，如浓度、均匀度、半成品活力、异常毒性实验等指标均高于国际标准，在有效性指标中我国对卡介苗在工作种子批的评价采用更为严格的成品动物感染保护力评价指标；在活菌热稳定性评价标准上，国内标准较WHO的推荐标准高；我国生产的卡介苗接种后能诱导很好的免疫反应，不良反应在正常范围内；上述这些情况，都是我国不选用进口卡介苗的原因。由于卡介苗接种人群的特殊性，检定机构应该重点关注卡介苗质量，还需不断地修订相关的质量标准，进一步提高我国卫生健康与结核病防治的服务水平。