三种检测技术诊断老年肺结核效能的比较研究

金法祥 许文芳 王晓萌 柳正卫 王华钧 陈雪芳 孙小军

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的慢性传染病，是严重危害人类健康的慢性传染病，近10余年来，由于艾滋病、移民和流动人口的增加，以及耐多药结核病患者的增多，全球结核病防治形势非常严峻[1]。在结核病的发病率和患病率中, 老年结核病逐年增加, 是结核病疫情流行的一大特征,老年结核病呈高患病率、高发病率和高病死率，值得引起高度重视[2]。所以，快速诊断老年结核病显得非常重要。笔者采用结核分枝杆菌及利福平耐药实时荧光定量核酸扩增(GeneXpert MTB/RIF)技术、发光二极管(light emitting diode，LED)荧光染色法和BACTEC MGIT 960系统液体培养(简称“MGIT液体培养”)对老年结核病患者结核分枝杆菌检测的结果进行比较，以评价3种检测技术的临床应用价值。

资料和方法

一、一般资料

收集2013年12月至2015年12月绍兴市立医院肺科和呼吸感染科收住入院的老年肺结核患者250例，均通过实验室病原学检测、影像学和临床症状综合分析而得到临床确诊。其中，男159例，女91例；年龄65～89岁，平均(70.3±6.2)岁。

二、 试剂与仪器

BACTEC MGIT960分枝杆菌培养系统及MGIT分枝杆菌培养管(美国Becton Dickinson公司)；GeneXpert MTB/RIF检测仪及试剂盒(美国Cepheid公司)，结核分枝杆菌抗原检测试剂由杭州创新生物技术公司提供；显微镜(日本OLYMPUS BX53)、低温高速离心机(美国Thermo Fisher Scientific 公司 ST16R)、生物安全柜(上海Heal Force 1200系列)。

三、 研究方法

收集250例患者的晨痰标本3～6 ml，于无菌塑料瓶内送检。每份痰液标本同时进行LED荧光法染色法、MGIT液体培养、GeneXpert MTB/RIF检测。

1. LED荧光染色：涂片、染色、显微镜检查操作参照2009年由中国协和医科大学出版社出版的《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》要求进行。荧光染色LED镜检标准在暗色背景下，抗酸杆菌呈黄绿色或橙色荧光。镜检结果按下列标准报告：(1)抗酸杆菌阴性：0条/50个视野。(2)抗酸杆菌阳性(报告抗酸杆菌数)：1～9条/50个视野。(3)抗酸杆菌阳性(+)：10～49条/50个视野。(4)抗酸杆菌阳性(++)：1～9条/每个视野。(5)抗酸杆菌阳性(+++)：10～99条/每个视野。(6)抗酸杆菌阳性(++++)：100条及以上/每个视野。

2. 分枝杆菌MGIT液体培养：离心管壁标记编号，将标本转移至离心管中，保证离心管内标本体积至少2 ml；加入等体积的N-乙酰-L-半胱胺酸(N-acetyl-L-cysteine，NALC)-NaOH混合溶液；旋紧盖子，涡旋震荡消化不超过30 s；室温静置15 min；加入0.067 mol的pH为6.8的磷酸盐缓冲液至40 ml； 3000×g，离心15 min, 温度控制4 ℃； MGIT分枝杆菌生长培养管(7 ml)中加入0.8 ml的OADC营养添加剂和PANTA杂菌抑制剂的混合试剂。前处理液离心后，将离心管取出，小心弃掉离心管内上清液，再加入0.5 ml磷酸盐缓冲液至离心管中混匀。吸取0.5 ml前处理后的悬浮液，接种于MGIT液体培养基, 放入BACTEC MGIT 960结核分枝杆菌培养仪。按照说明书进行结果判读。

3. GeneXpert MTB/RIF检测：取1 ml标本加入前处理管中，视标本性状加入2倍SR(样本处理试剂)标本处理液，涡旋振荡15～30 s,静置15 min；取2 ml处理后样品加入到GeneXpert的反应盒，自动进行PCR检测所需的3个步骤(样品核酸提取、扩增和检测)。采用GeneXpert检测系统，针对结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB的81 bp 利福平耐药核心区检测其是否发生突变。

四、 统计学处理

3种检测技术计数资料之间的比较采用χ2检测，以P<0.05为差异有统计学意义。GeneXpert MTB/RIF检测和MGIT液体培养进行一致性检验(Kappa检验)，K≤0.40时,表示一致性较差；0.40≤K≤0.60时,表示中度一致；0.600.80时,表示二者一致性极好。

结 果

一、LED荧光染色法、MGIT液体培养、GeneXpert MTB/RIF的检测结果

250例痰标本同时采用LED荧光染色法、MGIT液体培养、GeneXpert MTB/RIF检测，总体阳性检出率分别为36.00%(90/250)，48.40%(121/250)和50.40%(126/250)。GeneXpert MTB/RIF检测阳性率(50.40%)高于LED荧光染色法(36.00%),二者差异有统计学意义(χ2=10.56,P<0.01)；高于MGIT液体培养(48.40%)，但二者差异无统计学意义(χ2=0.20,P>0.05)；MGIT液体培养阳性率(48.40%)高于LED荧光染色法(36.00%),二者差异有统计学意义(χ2=7.88,P<0.01)。

二、GeneXpert MTB/RIF 检测技术检测MTB的结果

以MGIT液体培养检测结果为标准, GeneXpert MTB/RIF 检测技术的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为95.93%(118/123)、93.70%(119/127)、93.65%(118/126)、95.97%(119/124), GeneXpert MTB/RIF 检测技术和MGIT液体培养法进行Kappa检验,K=0.90,两者具有极好的一致性(表1)。

三、涂阳痰标本GeneXpert MTB/RIF与MGIT液体培养检测结果比较

涂阳痰标本90例，MGIT液体培养结果阳性85例，阳性率为94.4%；GeneXpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌结果阳性86例，阳性率为95.6%； 2种检测技术检出阳性率比较，差异无统计学意义(χ2=0.12,P>0.05)

四、涂阴痰标本GeneXpert MTB/RIF与MGIT液体培养检测结果比较

涂阴痰标本160例，MGIT液体培养阳性36例，阳性率为22.5%； GeneXpert MTB/RIF检测阳性40例，阳性率为25.0%；2种检测技术检出阳性率比较，差异无统计学意义(χ2=0.28,P>0.01)。

讨 论

结核病细菌学检测是发现结核病病原学的主要途径，是确定结核病诊断及进行抗结核药物治疗的重要依据。涂片染色方法简单快速，但敏感度较低[3-4]。老年结核病患者多数临床症状不明显, 发病隐匿,部分出现咳嗽、血痰、胸痛、气促,常被误诊为慢性阻塞性肺病(COPD)或老年慢性支气管炎,忽视了痰液和影像学检查，不能被及时发现,耽误老年结核病最佳发现及诊断治疗的时机，易误诊或漏诊。

本研究结果显示，3种检测技术比较，GeneXpert MTB/RIF检测的阳性率为50.40%，GeneXpert MTB/RIF检测阳性率高于LED荧光染色法(36.00%),二者差异有统计学意义(χ2=10.56,P<0.01)；高于MGIT液体培养(48.40%)，但二者差异无统计学意义(χ2=0.20,P>0.05)；MGIT液体培养阳性率(48.40%)高于LED荧光染色法(36.00%),二者差异有统计学意义(χ2=7.88,P<0.01)。

本研究结果显示，90例涂阳老年结核病患者，MGIT液体培养的阳性率为94.4%；GeneXpert MTB/RIF检测的阳性率为95.6%，二种方法检测结果差异无统计学意义。160例涂阴老年结核病患者，MGIT液体培养的阳性率为22.5%； GeneXpert MTB/RIF检测的阳性率为25.0%，二种方法检测结果差异无统计学意义。肺结核中老年结核病常见,多为继发性肺结核。即以前曾经患有肺结核,经过治疗后病情稳定,由于机体免疫力低下等原因引起结核病复发；老年人自身免疫力低下,加之营养状况和生活条件等因素，易感染而引起发病；多年前的结核病没有根治直接延续到老年期等[5-6]。

本研究结果显示，GeneXpert MTB/RIF与MGIT液体培养检测结果具有高度一致性(K=0.90)。同时GeneXpert MTB/RIF技术可以同时检测结核分枝杆菌是否对利福平耐药，其原理主要是检测结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB的81 bp核心区，判断是否对利福平耐药[7-12]，因此该技术具有一定的临床应用价值，优势比较明显。总之，GeneXpert MTB/RIF技术是一种快速、方便、特异度强、敏感度高的检测方法[13]，适合于在各基层结核病防治机构中推广使用。

表1 GeneXpert MTB/RIF与MGIT液体培养检测MTB的结果比较

注以MGIT液体培养为标准，得出GeneXpert MTB/RIF检测MTB的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。计算公式如下：敏感度(%)=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度(%)=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值(%)=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值(%)=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%