DNA微阵列芯片法检测耐药结核分枝杆菌的临床应用价值研究

单永梅 王伟炳 王建美

耐多药结核病已成为当前我国结核病防治工作面临的主要挑战之一[1]。结核分枝杆菌生长缓慢，目前实验室检测的传统方法是先培养后再进行比例法药物敏感性试验(简称“药敏试验”)，在检测顺利的情况下，至少耗时2～3个月。传统培养加药敏试验检测虽结果可靠，但费时且不利于患者的早期治疗，可能促使耐药菌株的增多和播散。研究显示，应用DNA微阵列芯片法可快速、准确地检测结核分枝杆菌及其耐药性[2-6]。笔者以传统罗氏培养和比例法药敏试验检测结果为标准，评估DNA微阵列芯片法对涂阳患者痰标本中结核分枝杆菌的检出情况，及其对异烟肼和利福平耐药性检测的效果，从而评估DNA微阵列芯片法的应用价值。

材料和方法

一、材料收集

收集2011年1月至2017年5月间在江苏省灌云县疾病预防控制中心登记的814例涂阳肺结核患者的痰标本。凡符合下列三项之一者为涂阳肺结核患者：(1)2份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性；(2)1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性，肺部影像学检查符合活动性肺结核表现；(3)1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性，1份痰标本结核分枝杆菌培养阳性[7]。涂阳肺结核患者中，男627例(77.03%)，女187例(22.07%)；年龄范围16～98岁，中位年龄53(30，66)岁。将新发患者与2、3个月末痰涂片阳性者归为初治患者；将复发、返回、初治失败、复治失败、其他归类为复治患者[8]；初治涂阳患者599例(73.59%)，复治涂阳患者215例(26.41%)。

二、传统罗氏培养和比例法药敏试验

由县级结核病定点医院的实验室医生对痰标本进行粗筛，留下合格的标本(干酪样、褐色血痰、含有少量新鲜血液的血痰、黏液痰等)进行痰涂片检查，采用直接痰液涂片镜检法检测。痰标本的收集、涂片、镜检报告、质量控制及涂片保存等均严格按照《结核病诊断实验室检验规程》[9]。对于不合格的标本，退回并进一步指导患者重新留痰送检。涂阳标本统一送市级结核病定点医院做快速诊断、传统罗氏培养和比例法药敏试验。培养基购自珠海贝索生物技术有限公司，所有操作与结果判读严格按照标准操作规程和仪器或设备说明书进行。

1. 菌悬液制备和稀释：用接种环取2～5 mg培养基上的菌落，研磨后与标准麦氏管比对，配制成1 mg/ml 的菌悬液，梯度稀释为10-1、10-2和10-4mg/ml。

2. 罗氏培养：吸取0.1 ml浓度为10-1mg/ml的菌悬液，分别接种到对照罗氏培养管及对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)两种药敏罗氏培养基表面，尽量使菌液均匀铺满斜面。接种后的培养基于37 ℃培养4周后观察结果。判断标准：(1)若PNB(-)和TCH(+)，初步鉴定为结核分枝杆菌；(2)若PNB(-)和TCH(-)，初步鉴定为牛分枝杆菌；(3)若PNB(+)和TCH(+)，初步鉴定为非结核分枝杆菌菌群。罗氏培养基购自珠海贝索生物技术有限公司，规格为7 ml/支。

3. 比例法药敏试验：用标准接种环分别沾取1满环(即0.01 ml)10-2和10-4mg/ml的菌悬液，用划线法均匀接种至对照培养管培养基表面和药敏培养管培养基表面，尽量使菌液均匀铺满斜面。接种后的培养基于37 ℃培养4周后观察结果。耐药百分比(%)=(含药培养基上生长的菌落数)/(对照培养基上生长的菌落数)×100%。耐药百分比≥1%，报告耐药(R)；耐药百分比<1%，报告敏感(S)。若10-4mg/ml浓度的菌悬液在对照培养基上生长的菌落数少于20个菌落，则应从对照管传代培养，重复试验。药敏试验培养基购自珠海贝索生物技术有限公司，规格为7 ml/支。

4. 分离培养和药敏熟练度测试：分离培养涂阳培阴率小于10%，污染率小于5%；比例法药敏试验操作人员须通过国家药敏熟练度考核测试。

三、DNA微阵列芯片法

1.检测原理：以临床样品中分离的结核分枝杆菌DNA为模板，运用不对称PCR技术进行扩增反应，由于引物末端标记有荧光分子，在扩增过程中待检测的DNA分子将被扩增为带有荧光分子的DNA片段。将标记有荧光分子的PCR扩增产物与芯片上的探针在一定条件下进行杂交反应，根据碱基互补配对原则，序列匹配的PCR扩增产物与探针形成稳定的二级结构。根据探针在芯片上的特定位置排布，可判读相应被测细菌信息，从而鉴定出该细菌的种类与判断耐药情况。晶芯®分枝杆菌菌种鉴定系统和晶芯®结核分枝杆菌耐药基因检测系统均购自北京博奥生物有限公司。

2. 操作步骤：(1)痰标本处理。取患者痰液标本2～3 ml，加入1～2倍体积现配4% NaOH溶液，振荡混匀，室温静置15～20 min，吸取1 ml上清液于微量离心管中，离心半径13.5 cm ，5000 r/min 离心5 min，弃去上清液，再加入1 ml生理盐水，充分振荡后，离心半径13.5 cm ，5000 r/min离心5 min，弃去上清液。(2)核酸DNA提取。向离心管加入80 ml 核酸提取液，振荡混匀后转入核酸提取管中，加入上一步经处理后的痰液标本，用晶芯Extractor TM36核酸快速提取仪振荡5 min，95 ℃水浴5 min，离心半径13.5 cm ，5000 r/min离心1 min。(3)PCR扩增：每份样品进行3管PCR扩增反应。将PCR扩增试剂1、2、3各18 ml分别放入3管，将核酸提取物2 ml依次加入到3个管中，每管PCR反应体系总体积为20 ml。扩增条件：37 ℃ 600 s，1个循环；94 ℃ 600 s，1个循环；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35个循环；94 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，10个循环；72 ℃ 420 s，1个循环；分别得到PCR产物1、2、3。(4)芯片杂交：将PCR产物1、2、3置于PCR仪中95 ℃变性5 min，随后立即置于冰水混合物中5 min；按照9 ml杂交缓冲液、3 ml PCR产物1和 3 ml PCR产物2配制杂交混合物R；9 ml杂交缓冲液、3 ml PCR产物1和3 ml PCR产物3配制杂交混合物H。吸取13.5 ml杂交混合物R和杂交混合物H分别经盖片加样孔加入利福平微阵列(微阵列1或3)和异烟肼微阵列(微阵列2或4)中，迅速盖上杂交盒并密封，立即放入芯片杂交仪中50 ℃杂交2 h，转速为5 r/min。(5)芯片清洗干燥及结果判读：杂交反应结束后，将杂交盒水平取出拆开，将芯片取出，使用SideWasherTM8芯片洗干仪清洗芯片，使用晶芯®LuxScanTM10K-B微阵列芯片扫描仪和晶芯®菌种鉴定检测分析系统、晶芯®分枝杆菌药敏检测分析系统进行信号的读取及结果判断。

3. 质量控制：试验前对实验室操作人员进行技术培训，对20份质量控制标本(结核分枝杆菌DNA标本)进行熟练度测试，符合率为100%。

四、统计学处理

应用EpiData 3.1软件进行数据的录入并进行一致性检验，SAS 9.2软件对数据进行统计分析。利用传统罗氏培养及药敏试验的检测结果作为标准，评价DNA微阵列芯片法的检测效能。各项指标的计算方法：敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%。采用Kappa检验对检测结果可靠性进行评价，Kappa值判定标准： 0.0～0.20为极低一致，0.21～0.40为一般一致，0.41～0.80为中高度一致，0.81～1.00为完全一致[10]。计数资料的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、结核分枝杆菌检出情况

DNA微阵列芯片法对涂阳肺结核患者的结核分枝杆菌检出率为86.1%(701/814)，高于传统罗氏培养法的82.4%(671/814)，差异有统计学意义(χ2=6.81，P<0.05)。以传统罗氏培养法检测结果作为标准，DNA微阵列芯片法检测涂阳患者结核分枝杆菌敏感度和特异度分别为92.4%和43.4%，Kappa=0.39，阳性预测值和阴性预测值分别为88.5%和54.9%，见表1。

DNA微阵列芯片法对初治涂阳肺结核患者结核分枝杆菌检出率为88.5%(530/599)，传统罗氏培养法的检出率为88.5%(530/599)，差异无统计学意义(χ2=0.00，P=1.000)。以传统罗氏培养法检测结果作为标准，DNA微阵列芯片法检测初治涂阳患者结核分枝杆菌的敏感度和特异度分别为93.4%和49.3%，Kappa=0.43，阳性预测值和阴性预测值分别为93.4%和49.3%，见表1。

DNA微阵列芯片法对复治涂阳肺结核患者的结核分枝杆菌检出率为79.5%(171/215)，高于传统罗氏培养法的65.6%(141/215)，差异有统计学意义(χ2=14.52，P<0.05)。以传统罗氏培养法检测结果作为标准，DNA微阵列芯片法检测复治涂阳患者结核分枝杆菌的敏感度和特异度分别为88.7%和37.8%，Kappa=0.29，阳性预测值和阴性预测值分别为73.1%和63.6%，见表1。

二、耐药检测情况

814例进行传统罗氏培养的涂阳肺结核患者中，671例检测结果为“结核分枝杆菌”，43例检测结果为“非结核分枝杆菌病”，76例(9.3%)为“培养阴性”，24例(2.9%)为“培养污染”，分离培养涂阳培阴率小于10%，污染率小于5%，符合质量控制要求。对814例涂阳肺结核患者的传统罗氏培养法与DNA微阵列芯片法结果进行比较，剔除无效结果包括传统罗氏培养法中鉴定为非结核分枝杆菌、培养阴性、培养污染与DNA微阵列芯片法中判定非结核分枝杆菌(9例)、结果无法判读(87例)、未检测到分枝杆菌(17例)等情况，共获得620例患者的有效结果并对其进行分析，见图1。620例患者中，男470例(75.8%)，女150例(24.2%)；初治涂阳患者495例(79.8%)，复治涂阳患者125例(20.2%)。

表1 DNA微阵列芯片法对涂阳肺结核患者结核分枝杆菌的检测效能(以传统罗氏培养法为标准)

注阳性表示检测结果为结核分枝杆菌；阴性表示检测结果为其他(包括传统罗氏培养法中鉴定为非结核分枝杆菌、培养阴性、培养污染；DNA微阵列芯片法中判定为非结核分枝杆菌、结果无法判读、未检测到分枝杆菌等情况)

图1 进行耐药情况分析的有效患者纳入流程图

以比例法药敏试验检测结果为标准，DNA微阵列芯片法检测初治涂阳患者是否耐多药的敏感度和特异度分别为90.5%和100.0%，Kappa=0.97，阳性预测值和阴性预测值分别为100.0%和99.6%；检测复治涂阳患者是否耐多药的敏感度和特异度分别为69.6%和98.0%，Kappa=0.74，阳性预测值和阴性预测值分别为88.9%和93.5%；检测初治涂阳患者是否对异烟肼耐药的敏感度和特异度分别为78.7%和96.4%，Kappa=0.71，阳性预测值和阴性预测值分别为69.8%和97.7%；检测复治涂阳患者是否对异烟肼耐药的敏感度和特异度分别为71.9%和95.7%，Kappa=0.71，阳性预测值和阴性预测值分别为85.2%和90.8%；检测初治涂阳患者是否对利福平耐药的敏感度和特异度分别为84.6%和98.3%，Kappa=0.77，阳性预测值和阴性预测值分别为73.3%和99.1%；检测复治涂阳患者是否对利福平耐药的敏感度和特异度分别为89.3%和96.9%，Kappa=0.86，阳性预测值和阴性预测值分别为89.3%和96.9%，见表2。

讨 论

实验室构建检测结核分枝杆菌方法的优劣是控制耐药疫情的关键。传统的耐多药肺结核诊断方法是对患者的痰标本进行细菌培养和药敏试验，一般需要2～3个月时间得到结果，不能解决耐多药肺结核患者的早期诊断问题，在传播的过程中加剧了耐药结核病的发展。近10年来，结核分枝杆菌耐药性呈逐年上升趋势[11-12]，异烟肼和利福平作为抗结核一线药物，其耐药性检测对于临床结核病药物治疗具有重要意义[13]。新型的分子检测技术是近年来开发用于检测结核分枝杆菌耐药基因的热点技术[14]，DNA微阵列芯片法作为一种高通量自动化检测技术，能为临床耐药结核病的筛查与防治提供良好的技术支持[15]。

表2 DNA微阵列芯片法对涂阳肺结核患者耐药情况的检测效能(以比例法药敏试验为标准)

2013年，刘亚芹等[5]通过DNA微阵列芯片法和比例法同时对54株结核分枝杆菌进行异烟肼和利福平的耐药性检测，对结果进行比较分析后发现，DNA微阵列法对异烟肼和利福平的耐药检测结果与比例法的符合率分别为75.00%和91.00%，认为DNA微阵列芯片法适用于临床一线对耐药结核分枝杆菌的快速筛查。2014年，郝宝林等[2]对553例涂阳肺结核患者的痰标本同时进行DNA微阵列芯片法与传统比例法药敏试验，发现DNA微阵列芯片法的敏感度、特异度和一致率较高，认为DNA微阵列芯片法适用于对耐多药肺结核患者的辅助诊断。

笔者将DNA微阵列芯片法应用于结核分枝杆菌的检测及其对异烟肼和利福平的耐药性检测。与传统罗氏培养法相比，该法对结核分枝杆菌检出率高，与之前的研究结果一致[2,6]。分析可能的原因，DNA微阵列芯片法的检测原理是将标记有荧光分子的PCR扩增产物与芯片上的探针在一定条件下进行杂交反应，不依赖于痰液中结核分枝杆菌的生存状态，只要有核酸片段便可以进行检出；而传统罗氏培养法依赖于活菌的状态，受到结核分枝杆菌生命力的影响。

在耐药性检测方面，笔者对两种方法检测结果均为结核分枝杆菌的620例患者纳入分析，采用分层分析的方法比较DNA微阵列芯片法与传统比例法药敏试验的检测结果。以比例法药敏试验为标准，DNA微阵列芯片法对异烟肼耐药性检测的敏感度与阳性预测值较低，推测与该方法检测异烟肼耐药相关基因靶位点较少有一定的关系(博奥生物有限公司晶芯®结核分枝杆菌耐药基因检测中异烟肼耐药靶位点为katG基因315位点AGC→ACC和AGC→AAC两个突变型，inhA基因启动子-15位点C→T突变型)。本次研究中 DNA 微阵列芯片对耐多药及异烟肼、利福平耐药性检测均显示了较高的特异度(均>95.0%)和阴性预测值(均>90.0%)，但阳性预测值较低，均与传统比例法药敏试验保持了很高的一致性(Kappa值均>0.7)，这对于耐药结核病患者的鉴别诊断有重要意义。

综上所述，DNA微阵列芯片法具有快速、敏感度与特异度高的特点，可用于临床快速检测结核分枝杆菌的耐药株，为临床诊断、选择和调整耐药结核病患者的治疗方案提供参考，在积极应对结核病尤其是耐多药结核病、遏制结核病的传播等方面有重要意义。