桑黄菌丝体多糖的提取及其免疫活性研究

（衡水学院，河北衡水053000）

桑黄是一种珍贵的药用真菌，其医疗保健功能很高，桑黄多糖为其主要的活性成分[1-3]。目前常用低温低压法、热水浸提法、超声提取法和微波提取法等方法提取桑黄多糖[4-7]。低温低压法和热水浸提法为提取真菌多糖的传统方法，这些方法提取时间长、提取率比较低；超声提取法和微波提取法相对热水浸提法提取时间短，提取率都要高[6]，但提取率仍不够理想。目前，将超声提取法和微波提取法结合起来提取桑黄菌丝体多糖的报道很少见，本研究拟用超声波-微波协同法提取桑黄菌丝体多糖，旨在最大限度提高其提取率，并对提取的桑黄菌丝体多糖进行免疫活性方面的研究，为进一步开发桑黄提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑黄：衡水学院发酵工程实验室提供。为液体发酵得到的桑黄菌丝体，60℃下恒温烘干。

苯酚：成都荣成化工有限公司；浓硫酸：任丘市九环化工有限责任公司；葡萄糖：洛阳丹城葡萄糖有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SXT-CW-2000型超声-微波协同反应仪：北京恒奥德仪器仪表有限公司；722型分光光度计：上海屹谱仪器制造有限公司；FA1004C型电子天平：河南兄弟仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超声-微波法提取桑黄菌丝体多糖

1.3.1.1 提取工艺[7-10]

桑黄菌丝体→粉碎（分别过不同孔径的筛网来调节物料粒度）→加蒸馏水浸泡→置于超声-微波协同反应仪，固定超声功率→微波辐射→离心→得上清液→浓缩为原体积的1/4→加入乙醇进行沉淀→离心→得沉淀→冷冻干燥→桑黄菌丝体多糖

1.3.1.2 桑黄菌丝体多糖的测定[11]

采用苯酚-硫酸法制作标准曲线（见图1），以葡萄糖的毫克数为横坐标，吸光度值为纵坐标。波长490 nm下，测得标准曲线回归方程：y=6.720 5 x，相关系数R2=0.999 1。再测定桑黄菌丝体多糖样品的吸光度，然后根据标准曲线的回归方程计算样品的多糖含量。

图1 苯酚-硫酸标准曲线Fig.1 Standard curve of phenol-vitriol

1.3.2 试验设计

1.3.2.1 单因素试验

最佳物料粒度的确定[12-13]：固定超声波功率为250 W，微波功率550 W，微波处理时间8 min，料液比1∶20（g/mL）。最佳物料粒度依次为0.125（对应标准目数：120 目）、0.150（100 目）、0.180（80 目）、0.250（60 目）、0.425（40目）mm的条件下，测定桑黄菌丝体多糖含量，并计算多糖提取率。根据测定桑黄菌丝体多糖的含量，确定最佳物料粒度。

最佳料液比的确定：采用得到的最佳物料粒度，固定超声波功率为250 W，微波功率550 W，微波处理时间 8 min。料液比依次为 1 ∶15、1∶20、1∶25、1 ∶30、1∶35（g/mL）的条件下，测定桑黄菌丝体多糖含量，确定最佳料液比。

最佳微波功率的确定：采用得到的最佳料液比和最佳物料粒度，固定超声波功率为250 W，微波处理时间 8 min，微波功率依次为 400、450、500、550、600 W的条件下，测定桑黄菌丝体多糖含量，确定最佳微波功率。

最佳微波处理时间的确定：采用得到的最佳物料粒度、最佳料液比和最佳微波功率，固定超声波功率为 250 W，微波处理时间依次为 4、6、8、10、12 min 的条件下，测定桑黄菌丝体多糖含量，确定最佳微波处理时间。

1.3.2.2 正交试验

根据单因素试验结果，在固定超声波功率为250 W的条件下，选择料液比、物料粒度、微波功率、微波处理时间，进行四因素三水平正交试验设计。测定桑黄菌丝体多糖含量，并计算多糖提取率来确定最佳的提取工艺条件。L9（34）正交表的因素水平见表1。

表1 L9（34）正交试验因素水平表Table 1Factors and levels of L9（34）orthogonal test

1.3.2.3 免疫活性的测定[14-15]

颈椎脱臼处死小鼠，无菌操作下取小鼠的脾脏，然后研磨成细胞悬液。在96孔酶标板中，每孔加入细胞悬液100 μL，加完全培养液20 μL作为阴性对照；加完全培养液10 μL和Con A（刀豆蛋白A）10 μL作为阳性对照；取桑黄菌丝体多糖样品，配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mg/mL 的溶液，阳性试验孔同时加入桑黄菌丝体多糖样品溶液10 μL和Con A 10 μL，置于5%的CO2培养箱中（温度为37℃）培养72 h。细胞培养结束前6小时时，每孔加入无菌的噻唑蓝10 μL（浓度为5 mg/mL）。培养完成后，每孔加10%的十二烷基硫酸钠100 μL终止其反应，490 nm波长下测定各孔的OD值。免疫调节活性采用刺激指数（stimulate index，SI）表示。SI值越大，表明桑黄菌丝体多糖的免疫活性越强。

式中：SI为刺激指数；OD1为桑黄菌丝体多糖样品在490 nm处的吸光度值；OD2为阳性对照组在490 nm处的吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 物料粒度对桑黄菌丝体多糖提取率的影响

物料粒度对桑黄菌丝体多糖提取率的影响见图2。

图2 物料粒度对桑黄菌丝体多糖提取率的影响Fig.2 The material size influencing for extraction rate of polysaccharide from Phellinus igniarius Mycelia

由图2可知，当物料粒度达到0.180 mm时，多糖提取率最高，桑黄菌丝体多糖提取率为4.437%。随着物料粒度增大，微波产生的能量到达物料颗粒中心的距离增大，作用效果变弱，多糖提取率逐渐降低；但是物料粒度过小，会导致物料发生焦糊现象，不利于多糖溶出，多糖提取率也会降低。

2.1.2 料液比对桑黄菌丝体多糖提取率的影响

料液比对桑黄菌丝体多糖提取率的影响见图3。

图3 料液比对桑黄菌丝体多糖提取率的影响Fig.3 The ratio of material to liquid influencing for extraction rate of polysaccharide from Phellinus igniarius Mycelia

由图3可知，当料液比为1∶15（g/mL）时，由于溶剂量偏少，桑黄菌丝体多糖未能充分溶出，多糖提取率偏低，随着溶剂的增多，多糖提取率逐渐提高，当料液比为1∶25（g/mL）时，提取率达到最高，桑黄菌丝体多糖提取率为4.493%。当料液比在1∶25（g/mL）以后，随着溶剂的进一步增多，多糖提取率逐渐降低。

2.1.3 微波功率对桑黄菌丝体多糖提取率的影响

微波功率对桑黄菌丝体多糖提取率的影响见图4。

图4 微波功率对桑黄菌丝体多糖提取率的影响Fig.4 The microwave power influencing for extraction rate of polysaccharide from Phellinus igniarius Mycelia

由图4可知，当微波功率高于400 W时，伴随着桑黄吸收微波能量逐渐增大，多糖提取率逐渐提高，功率达到500 W时，多糖提取率达到最高值，桑黄菌丝体多糖提取率为4.832%。但当功率高于500 W后，多糖结构部分被破坏，发生一定程度降解，多糖提取率又逐渐降低。

2.1.4 微波处理时间对桑黄菌丝体多糖提取率的影响

微波处理时间对桑黄菌丝体多糖提取率的影响见图5。

图5 微波处理时间对桑黄菌丝体多糖提取率的影响Fig.5 The microwave time influencing for extraction rate of polysaccharide from Phellinus igniarius Mycelia

由图5可知，当微波处理时间为6min，多糖提取率最高，桑黄菌丝体多糖提取率为5.017%。微波处理时间较短时，物料中微波能量积累少，桑黄细胞破碎的程度小，多糖溶出少，多糖提取率就低；随着微波处理时间的延长，细胞破碎的程度在增大，多糖溶出增多，多糖提取率升高；但是当时间超过6min后，其它杂质也开始溶出，多糖提取率也逐渐降低。

2.2 L9（34）正交试验优化提取工艺的研究

正交试验数据分析结果见表2、表3。

由表2和表3得知，物料粒度、微波功率和微波处理时间对桑黄菌丝体多糖提取率均有显著地影响。按对提取率影响的重要性而言：C＞B＞D＞A，即微波功率＞物料粒度＞微波处理时间＞料液比。在固定超声波功率为250 W的条件下，确定最佳的试验组合为A2B1C2D2，即料液比1∶25（g/mL），物料粒度0.150 mm，微波功率500 W，微波处理时间6 min。

表2 L9（34）正交试验对多糖提取率影响分析Table 2L9（34）Orthogonal test analysis of the impact of extraction rate of polysaccharide

表3 L9（34）正交试验对多糖提取率影响的显著性分析Table 3L9（34）Orthogonal test of the impact of significant extraction rate of polysaccharide analysis

2.3 验证试验

采用超声波-微波协同法最佳条件进行试验。做3个平行样，再取平均值，得桑黄菌丝体多糖提取率为5.316%，高于超声波法（桑黄菌丝体多糖提取率3.02%）和微波提取法的提取率（提取率4.18%）[6]。

2.4 小鼠免疫调节活性的影响

提取的桑黄菌丝体多糖对小鼠脾细胞免疫活性的影响见图6。

图6 桑黄菌丝体多糖样品对小鼠脾细胞免疫活性的影响Fig.6 Effects of Phellinus igniarius Mycelia polysaccharides on splenic lymphocyte multiplication

如图6所示，不同浓度的桑黄菌丝体多糖的SI（刺激指数）均大于1，表明在一定剂量下，提取的桑黄菌丝体多糖可以促进小鼠脾淋巴细胞的增殖。桑黄菌丝体样品浓度达到0.2 mg/mL后，对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的促进作用随多糖样品浓度的提高逐渐增强；当多糖样品浓度达到1.0 mg/mL时，SI（刺激指数）为1.67，免疫调节活性达到最强；但当多糖样品浓度在超过1.0 mg/mL后，小鼠免疫调节活性呈下降趋势，其机理尚不清楚，有待于深一步研究。

3 结论

本研究采用超声波-微波协同法，通过单因素和正交试验确定了桑黄菌丝体多糖的最佳提取条件为：料液比1∶25（g/mL），物料粒度0.150 mm，超声波功率为250 W，微波功率500 W，微波处理时间6 min。此条件下桑黄菌丝体多糖提取率为5.316%。小鼠免疫调节活性试验表明，在一定剂量范围内，桑黄菌丝体多糖能明显增强小鼠的免疫功能，本试验为进一步大规模的开发桑黄菌丝体多糖提供了基础。